聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates或PHAs)是由多种细菌和某些古菌在营养不平衡条件下合成的胞内聚酯，主要作为碳源和能源的储藏物。到目前为止，有关古菌域中PHA生物合成相关基因的研究还未见任何报道。本论文对一株分离于死海的极端嗜盐古菌(llaloarcula marismortui ATCC43049)的全基因组序列信息进行了分析。通过体内遗传学和体外生物化学实验，对预测基因所编码蛋白的功能进行了阐明，并首次揭示了Haloarcula中PHA的生物合成途径。　　 首先，研究了H.marismortui积累PHA的培养条件。H.marismortui可积累占细胞干重21％的短链PHA。其中，主要由四碳单体3HB组成，五碳单体3HV的含量仅为2～3 mol％。H.marismortui积累PHA的最适碳源是葡萄糖，最适NaCl浓度为20％。丙酸的加入能够使其积累的PHA中五碳单体含量上升。　　 其次，从H.marismortui中克隆了可能编码PHA合酶的两个基因phaEHm和phaCHm，它们编码了类似于细菌域中的III类PHA合酶的两个亚基。通过引物延伸确定了两基因共同的转录起始位点。RT-PCR和Western杂交证明，在营养丰富和营养限制的培养条件下，PhaEHm和PhaCHm的表达水平基本相同。有趣的是，PhaCHm与PHA颗粒结合非常牢固，而PhaEHm却不能。将phaEHm和phaCHm单独或者共同导入Haloarcula hispanica，均可以提高重组菌中PHA的含量。其中，两个基因的共表达效果最明显，PHA的积累量达到野生菌的2.3倍。将H。hispanica的PHA合酶基因敲除后，菌株完全丧失了合酶的体外活性及积累PHA的能力。只有phaEHm和phaCHm同时互补后，才能恢复其积累PHA的能力。这一结果表明，在Haloarcula属中phaE及phaC基因对PHA的生物合成是必需的，可能共同编码了有活性的PHA合酶。　　 随后，初步探索了嗜盐菌PHA合酶的活性关键区域和活性位点。首先，将PhaEHm和PhaCHm融合表达，成功构建了一个有活性的PHA合酶。之后，在此融合蛋白的基础上，对合酶进行了截短和定点突变。将PhaCHm羧基端比细菌长出的110个氨基酸截去后，其体内活性大约是野生型的50％。因此，羧基端长出的序列对维持H.marismortui的PHA合酶活性有一定的作用，但并不是必需的。PhaEHm和PhaCHm氨基端的截短实验表明，PhaCHm的V43-E79和PhaEHn的M26-R63中的某些氨基酸序列，对PHA合酶活性的维持有重要的作用。对预测的三联体氨基酸催化位点C162，H346，D317和H318以及发挥重要作用的氨基酸位点C143，C190和W366进行了定点突变。三联体催化氨基酸和H318的突变，导致PHA合酶的体内活性急剧降低，甚至丧失活性。这与细菌中相应研究的结果类似。但是，其它三个位点的突变结果与细菌中的有些不同。有关嗜盐菌PHA合酶结构与功能的关系还有待于进一步的研究。　　 最后，研究了Haloarcula属PHA合成过程中，负责编码前体供应酶类的基因。在H.hisparuca中克隆了一个编码PHA合成特异的乙酰乙酰-CoA还原酶(PhaBHh)的基因。对其进行了基因敲除和互补，检测了重组菌胞内PHA的积累情况，并测定了全细胞蛋白的酶活。结果表明，PhaBHh以NADPH为辅因子，能将乙酰乙酰-CoA有效的还原为(R)-3-HB-CoA，从而为PHA的合成提供单体。此外，通过共表达phaBHh与phaECHh，在不积累PHA的菌株中重建了PHB的生物合成途径。这表明，PhaBHh在极端嗜盐古菌中，可能都具有提供(R)-3-HB-CoA单体的能力。随后，在H.hispanica中对几个可能的β-酮硫解酶与PHA合成的关系进行了初步探索。结果表明，AcaB1和AcaB3可能通过形成异源复合物，发挥PhaA的活性，催化两分子乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA。　　 本论文的研究工作表明，由PhaA，PhaB和PhaEC共同催化的，从乙酰-CoA开始合成PHA的途径，不仅广泛存在于细菌域，在古菌域中也同样存在。