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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge.)是唇形科鼠尾草属植物,其干燥根是中医临床常用的一味中药,具祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效。中医临床上,丹参主要用来治疗冠心病、脑血栓、肝炎及肝硬化等。丹参的水溶性成分以丹酚酸A(Salvianolic acid A,SA-A)和丹酚酸B(Salvianolic acid B,SA-B;又称紫草酸 Lithersperumic acid B)、迷迭香酸(Rosmarinic acid,RA)的含量最高,活性最强,最具药用价值。化学结构上这些化合物都含有至少一个苯环和与苯环相连的的羟基,表现出不同程度的酸性,属水溶性酚酸类化合物(丹酚酸类化合物)。有关丹酚酸类化合物生物合成途径的研究很少,洋紫苏中迷迭香酸生物合成的研究可为我们提供一些借鉴。研究发现,4-羟基苯丙酮酸还原酶(Hydroxyphenylpyruvic acid reductase,HPPR)在迷迭香酸生物合成过程中起关键作用的酶,它催化4-羟基苯丙酮酸变为4-羟基苯乳酸(Hydroxyphenyllactic acid),而4-羟基苯乳酸是合成迷迭香酸的前体物质之本研究克隆了丹参的hppr基因,并对其功能和表达调控进行了研究,具体内容如下:
1.根据己发表的洋紫苏(Coleus blumei Benth.)的hppr基因序列,通过RACE方法克隆了丹参的hppr基因(Sin hppr)。该基因的ORF共942bp。该基因与洋紫苏hppr基因的开放读框序列核酸和氨基酸水平的同源性分别为87%和88%。在ORF的423/424bp间有内含子,含有GT/AG剪接位点。
2.丹参毛状根中Sm hppr基因受MeJA诱导后12hr的表达量最高。利用Sm hppr基因的cDNA序列构建原核表达载体和植物表达载体,通过原核表达获得了40kD的外源蛋白;对转基因拟南芥进行酚酸类物质含量测定,发现转基因拟南芥中的4-羟基苯乳酸(HPPR产物)及酚酸类物质含量有明显提高。
3.通过染色体步行克隆Sm hppr基因的启动子序列1.5kb。PlantCARE软件分析发现Sm hppr基因启动子中有一些调控元件。将不同长度的基因启动子片段与GFP(绿色荧光蛋白)基因连接构建载体,并转化拟南芥。RT-PCR研究报告基因的表达状况发现:该基因转录起始位点上游500bp 长度的序列具有基本的启动子功能。
对Sm hppr基因功能与调控的研究对阐明丹酚酸类物质的生物合成代谢途径具有重要意义,也将为应用基因工程手段提高中药材有效成分含量提供科学依据。