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谷氨酸棒杆菌是一株重要的工业菌株,广泛用于生产氨基酸、有机酸等方面,同时,它也是研究芳香烃代谢和同化的模式系统。谷氨酸棒杆菌ATCC13032通过龙胆酸途径分解代谢3-羟基苯甲酸和龙胆酸。本文研究了该菌中3-羟基苯甲酸和龙胆酸代谢途径在转录水平上的调控。在其基因组中,参与3-羟基苯甲酸和龙胆酸代谢的基因可能位于genDFM、 genR和genKH等三个操纵子上。其中,genR基因编码一个IclR家族调控蛋白,其他基因编码3-羟基苯甲酸代谢所需的酶;genR基因缺失后,谷氨酸棒杆菌中的3-羟基苯甲酸和龙胆酸代谢功能丧失,这表明该调控蛋白可能正调控整个代谢途径。另外,生物信息学分析显示,CRP-FNR家族调控蛋白GlxR可能抑制这条代谢途径。本研究通过引物延伸、EMSA和DNaseⅠ足迹法等方法解析了启动子的结构,并研究了调控蛋白GenR和GlxR与每个启动子的结合情况,揭示它们对每个操纵子的作用方式,从而首次从分子水平阐释IclR家族调控蛋白和CRP-FNR家族调控蛋白同时参与3-羟基苯甲酸和龙胆酸代谢的调控机理。
结果表明,在谷氨酸棒杆菌中,3-羟基苯甲酸和龙胆酸代谢途径的编码基因位于genDF、genR和genKH等三个紧密排列的操纵子上。在3-羟基苯甲酸和龙胆酸的作用下,IclR家族调控蛋白GenR通过两种不同的模式上调genDFM和genKH两个操纵子的转录,同时下调它自身编码基因genR的转录。印迹实验和定点突变表明,在这个区域中,GenR通过不同的亲和能力结合四个位点。两个GenR结合位点(DFMn01和DFMn02)位于genDFM启动子-35区和-10区上游的-41到-81间的区域,并通过它们参与激活genDFM的转录,这属于Ⅰ类型简易激活模式。GenR结合位点R-KHn01(位于-47至16区之间)和genKH启动子序列的-35区重叠,用来参与上调genKH的转录,这属于Ⅱ类型简易激活模式。调控蛋白GenR在其自身编码基因genR的启动子区域结合R-KHn02位点,它的印迹区域从-44延伸到-67,这个位点参与下调genR启动子的活性。另外,在四个GenR结合位点中存在一个共有序列,它是由一个5bp不完美的回文结构[ATTCC-N7(5)-GGAAT]组成的,通过定点突变研究发现,这个结构是GenR参与调控所必须的。这些结果表明,在参与芳香烃代谢的IclR家族中,GenR行使着一种新的功能。
在谷氨酸棒杆菌中,CRP-FNR型调控因子GlxR行使着全局调控的作用,并参与了3-羟基苯甲酸和龙胆酸代谢的调控。印迹实验显示,GlxR在gen操纵子的启动子区域有三个结合位点,通过定点突变研究发现,GlxR通过这些位点部分抑制它们的转录。GlxR结合位点DFMx参与下调genDFM的转录,它位于genDFM启动子上游的-13至+8区,genKH启动子序列上游的GlxR结合位点R-KHx01(位于-11至+5区)参与下调genKH的转录,另外一个结合位点R-KHx02结合在他自身编码基因genR的启动子区域,并抑制其转录,这个位点结合在-71至-91区。
这些结果表明,IclR家族调控蛋白GenR通过两种不同的模式激活3-羟基苯甲酸/龙胆酸代谢途径基因genDFM和genKH的表达,同时,它还抑制自身编码基因genR的表达,而全局调控因子GlxR部分抑制这条代谢途径编码基因的转录。因此,3-羟基苯甲酸和龙胆酸代谢的gen操纵子的表达,是在调控因子GlxR和GenR一起同步控制下完成的。