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半胱氨酸组织蛋白酶cathepsin B主要存在于溶酶体中,是一种嗜酸性蛋白酶,能够水解胞内破损细胞器和蛋白质等,并且能够随小泡分泌到细胞外降解胞外基质中组分。斑马鱼中cathepsinb基因存在两种基因亚型,cathepsinba(ctsba)和 cathepsin bb(ctsbb)。本论文利用CRISPR/Cas9技术敲除了斑马鱼cathepsinba基因,并在子一代筛选获得cathepsinba杂合突变体。通过ctsbba杂合突变体互交获得子二代,部分胚胎在50%下包期胚胎发育出现停滞,其中一部分死亡,死亡数占全部胚胎的6.9%左右。另一部分胚胎在停滞约1-2h后恢复迟缓的发育,在咽囔期出现明显的形态畸形,包括心包囊肿、尾部折叠和弯曲等,发育至2-3天后死亡,这部分胚胎占全部胚胎数量的19.3%,经基因鉴定结果显示这些死亡胚胎均为纯合突变体。胚胎死亡率大概占全部胚胎数量的四分之一,符合孟德尔遗传定律,说明ctsba基因存在隐性致死效应。RT-PCR检测ctsba-/-突变体中发生非编码的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD),说明ctssa基因敲除成功。利用RT-PCR技术和原位杂交技术分析表明,cathepsinba为母源性和合子表达的基因,集中表达于动物极,在斑马鱼胚胎中广泛表达,且在卵黄合胞体层与神经管中表达量较高。利用背、腹部标记基因chordin和gata2进行原位杂交,发现在ctsbba杂合体和纯合突变体shield期chordin、gata2基因并未出现异常表达,但75%下包期chordin在ctsba--突变体背中线表达量减少。50%下包期是斑马鱼原肠胚期的开始,是三胚层分化形成的关键时期,利用内、中、外三胚层标记基因sox17、eve1、gsc在ctsba杂合突变体自交后代中进行原位杂交,根据原位杂交结果和基因型鉴定结果分析,在ctsba-/-胚胎中sox17、eve1、gsc均出现异常表达:sox17在75%下包期开始表达出现扩散现象,并且bud期内胚层前体细胞明显减少;evel在咽囔期胚胎尾部出现表达异常;gsc表达量从75%下包期开始比野生型明显降低。实验结果提示ctsba基因可能参与了斑马鱼背部发育,在斑马鱼原肠胚时期可能参与了细胞运动和三胚层形成,ctsba基因缺陷可能因此而导致广泛的胚胎畸形和致死效应。本论文还利用CRISPR/Cas9技术敲除了斑马鱼cathepsinbb基因,并筛选获得cathepsin bb突变体。