3-deazaneplanocin A（DZNep）是一种组蛋白甲基化酶抑制剂，且已被应用于抗肿瘤、抗寄生虫、抗病毒、抗关节炎以及免疫抑制活性等药理作用[1-3]。据报道，DZNep可使肿瘤中沉默的抑癌基因再活化，从而抑制肿瘤细胞的扩散，为治疗肿瘤提供了一个新型的靶点。另外，研究表明DZNep对于治疗肝癌、乳腺癌、髓母细胞瘤、急性髓系白血病、多形性胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、心脑血管疾病以及艾滋病等均能起到重要作用[4-9]。然而关于DZNep对食管鳞癌的作用报道甚少，因此本论文将对DZNep在食管鳞癌发生发展中的作用进行初步研究。食管鳞癌是我国较常见的消化道恶性肿瘤，其病发率和病死率位居全国恶性肿瘤第四位。一般情况下患者确诊时已为中期或者晚期，且容易复发，预后较差[10,11]。传统的食管鳞癌治疗方法主要包括外科手术治疗、化疗以及放疗，然而患者的治愈率以及预后情况并不乐观。由于诱发肿瘤的相关基因的变化是经过多阶段积累而成，因而在食管鳞癌癌变的不同阶段均涉及到多个癌基因的激活以及抑癌基因的失活。因此，寻找治疗食管鳞癌的分子靶向药物，联合其他治疗手段从而综合治疗食管鳞癌已迫在眉睫。S-腺苷高半胱氨酸水解酶（S-adenosylhomocysteine hydrolase, SAHH）作为甲基化通路中的重要限速酶，可催化体内细胞S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine, SAH）水解生成腺苷（adenosine, Ado）和高半胱氨酸（homocysteine, Hcy），该水解反应是S-腺苷高半胱氨酸代谢的唯一途径，且是一种可逆反应。腺苷在一系列酶的催化下可生成cAMP，后者作为细胞内的第二信使，可参与细胞信号转导[12]。同时，高半胱氨酸通过一系列催化反应，生成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethioine, SAM），SAM为体内转甲基反应提供甲基，在甲基转移酶的催化下生成S-腺苷高半胱氨酸，从而完成整个甲基化循环。可见，SAHH是生物体内转甲基反应的重要调控者，调控多种受体分子，例如蛋白、核酸以及一些信号转导分子等的甲基化反应[13]。EZH2是PRC2家族中的组蛋白甲基转移酶，主要介导肿瘤细胞的组蛋白去甲基化，在多种肿瘤细胞中过表达。EZH2通过催化组蛋白3第27位三甲基化（H3K27me3）修饰而诱导基因沉默[14]，且在调节转录调控和染色质状态方面也起到一定作用。已有证据表明，DZNep具有抗肿瘤活性，部分源于通过降低EZH2基因的表达和催化活性从而导致PRC2受到抑制。本研究拟通过一定浓度的DZNep处理食管鳞癌细胞系EC9706和Eca109细胞，并检测DZNep处理后细胞的细胞周期、增殖、迁移、凋以及粘附能力的变化，进而探讨DZNep对食管鳞癌细胞的影响。本研究主要分为两部分，第一部分对DZNep处理食管鳞癌细胞的条件进行探索和优化，第二部分检测DZNep处理食管鳞癌细胞后细胞周期、增殖、迁移、凋亡以及粘附能力的变化。方法1细胞培养食管鳞癌细胞EC9706、Eca109均为本实验室保存。两株细胞均在含有10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基中于37℃，含5%CO2的饱和湿度的细胞培养箱中培养。2DZNep处理食管鳞癌细胞条件的优化通过不同浓度的DZNep处理Eca109细胞，且处理不同时间后提取细胞总蛋白，煮沸使其变性，分别通过Western Blot方法以及RT-PCR方法检测SAHH、EZH2蛋白以及SAHH mRNA水平的表达，从而确定DZNep处理食管鳞癌细胞的最优条件。3DZNep对食管鳞癌细胞周期、增殖、迁移、凋亡及粘附因子影响的检测DZNep按照最优条件处理食管鳞癌细胞后，通过流式细胞术检测DZNep对EC9706和Eca109的细胞周期以及凋亡的影响，采用EdU荧光显微镜法和CCK-8法检测DZNep对细胞增殖能力的影响，利用Transwell小室法检测DZNep对细胞迁移能力的影响，Western Blot方法检测DZNep对细胞粘附因子的影响。结果1DZNep处理食管鳞癌细胞条件优化及其相关蛋白表达情况设置不同浓度DZNep处理Eca109细胞，分别处理48h和72h，通过Western Blot方法检测SAHH蛋白水平的表达情况。结果表明，Eca109细胞中SAHH的表达在DZNep浓度为5μmol/L，处理时间为48h时已经有所降低，细胞形态已发生变化且出现死亡细胞，因此我们选择其最适浓度为5μmol/L，最佳处理时间为48h。通过Western Blot以及RT-PCR分别检测DZNep处理后EC9706和Eca109细胞与对照组中SAHH蛋白和mRNA水平的表达变化，结果显示SAHH无论在蛋白水平还是mRNA水平均无明显变化（P>0.05）。此外，Western Blot检测结果表明，DZNep处理组中EZH2的表达明显低于对照组（P<0.05）。2DZNep对食管鳞癌细胞周期、增殖、迁移、凋亡及粘附因子影响的检测采用流式细胞术检测DZNep处理后食管鳞癌细胞株EC9706和Eca109细胞周期的变化，发现处理后的EC9706细胞周期无明显变化（P>0.05），而Eca109细胞周期与正常细胞相比有显著性差异（P<0.05）。EdU及CCK-8实验结果表明，EC9706和Eca109细胞DZNep处理组的增值率均明显低于对照组（P<0.05）。Transwell迁移实验结果表明，EC9706和Eca109细胞DZNep处理组迁移至下室的细胞数明显少于对照组（P<0.05）。利用流式细胞术检测细胞凋亡变化，结果表明两株细胞处理组凋亡率明显比对照组高（P<0.05）。最后Western Blot检测E-cadherin的表达水平变化，表明EC9706和Eca109细胞的处理组明显比对照组高（P<0.05）。结论确定了DZNep处理Eca109细胞的最适浓度为5μmol/L，最佳时间为48h。发现DZNep不仅能够抑制SAHH的表达，而且能够抑制EZH2的表达，且后者作用更明显。另外，DZNep能够抑制EC9706和Eca109细胞的增殖和迁移能力，促进其凋亡，使粘附因子表达上调。