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目的:Duchenne型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是进行性肌营养不良症中最常见的致死性X连锁隐性遗传肌病。该病是由于dystrophin基因发生了突变,使其编码的抗肌萎缩蛋白的完全或部分缺失,导致肌纤维膜完整性、稳定性破坏,最终导致肌肉的变性、坏死。DMD的主要临床表现为进行性肌肉无力、肌萎缩和腓肠肌假性肥大,随着疾病进展,DMD患者通常于12岁左右丧失行走功能,20岁左右因呼吸或心力衰竭死亡。DMD患者肌肉的主要病理特征为肌纤维直径大小不等,可见肌纤维肥大、萎缩、变性和坏死,炎性细胞浸润,肌纤维最终脂肪化和纤维化。然而dystrophin蛋白的缺失所致的肌细胞膜的不稳定性及机械损伤并不能完全解释DMD骨骼肌的持续性损害,在DMD的超早期阶段甚至在肌纤维的坏死发生之前,就已经存在炎性信号通路的异常激活。近年来,越来越多研究表明炎性反应及炎性通路的活化在DMD的发生和疾病进展中发挥着极其关键的作用。对炎性反应这一重要靶点的调节是DMD治疗极具前景的治疗方法。C57BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju鼠,简称mdx小鼠,是由于C57BL/10小鼠X染色体的23号外显子发生了点突变,导致其编码的dystrophin功能缺失而构建的DMD模型鼠,是目前研究DMD应用最广泛的动物模型。基因治疗是将正常的基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞,以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用。腺相关病毒载体(Adeno-associated virus,AAVs)是新近发展最为常用且具有临床应用前景的基因载体之一。AAVs可以长期高效表达,具有对机体低毒性、低细胞免疫源性和低致病性等优势。系统性评估表明AAV9可以有效地转染至骨骼肌和心肌。胰岛素样生长因子-l(insulin-like growth factor 1,IGF-1)是细胞增殖、分化和成熟过程中的重要营养因子。已有研究表明肌肉中特异性表达IGF-1基因可以增加mdx小鼠的肌纤维的再生,降低血清CK值且一定程度上改善肌力,这些效应是通过激活P13K/Akt信号通路实现的。IGF-1还可以从调节炎症反应方面作用于骨骼肌,有研究指出IGF-1是通过抑制巨噬细胞移动抑制因子(macrophge migration inhibitory factor,MIF)、高迁移率族蛋白B(high mobility group protein-1,HMGB1)和核转录因子kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的活性起到抗炎作用。之前的研究多集中在IGF-1对肌纤维再生的影响,很少关注IGF-1对肌肉炎症的作用。考虑到DMD是一种累及全身肌肉的肌病,尾静脉注射的方式更适宜临床应用。我们的研究是利用AAV9作为载体,携带hIGF-1基因一次性经尾静脉注射给予6周龄的mdx小鼠治疗。6周后通过常规组织病理染色,免疫荧光和蛋白免疫印迹(Western blot)技术评估mdx小鼠的炎症反应,并进一步探究hIGF-1的作用机制。方法:选取周龄6周的mdx小鼠,随机分为实验组(AAV9-hIGF-1组)和实验对照组(AAV9-GFP组),正常对照组为选取同等周龄的C57/10野生型小鼠,每组5只小鼠。给予实验组mdx小鼠尾静脉注射AAV9-hIGF-1病毒200μl(1×1012vg/ml),实验对照组mdx小鼠尾静脉注射AAV9-GFP病毒200μl(1×1012vg/ml),各组小鼠接受病毒尾静脉注射后同等条件下观察6周后取材。小鼠麻醉后分别剪取骨骼肌和心肌,进行包埋冰冻处理。荧光显微镜下观察肌肉组织中AAV9在mdx小鼠的转染情况后,观察hIGF-1蛋白的表达。HE染色、ACP染色观察炎症反应的变化。检测炎症相关蛋白CD68,PP65的表达。结果应用spss13.0对数据进行分析。结果:1 AAV9在mdx小鼠体内的表达mdx小鼠不同组织中GFP均有所表达,其中胫骨前肌GFP表达最多,肱三头肌表达次之,余组织仅可见较少量表达。2 AAV9-hIGF-1在mdx小鼠胫骨前肌的表达AAV9-hIGF-1组mdx小鼠胫骨前肌hIGF-1的表达效率较高,但仍有部分肌纤维未见表达。3 AAV9-hIGF-1对mdx小鼠肌肉的炎症反应的影响HE染色和ACP染色观察到AAV9-GFP组可见散在分布的吞噬现象,数个融合成片的炎细胞浸润,AAV-9hIGF-1组炎细胞浸润较分散,可见少量小灶状炎细胞浸润。CD68是巨噬细胞可靠的标记物,通过免疫荧光染色观察到AAV9-hIGF-1组CD68+细胞较AAV-GFP组减少。对胫前肌炎症区域所占百分比进行统计学分析,AAV-hIGF-1组为(1.78±0.47%),低于AAV-GFP组(3.4±1.22%),高于正常组(0%),差异均有统计学意义(p<0.05)。4 NF-κB信号通路的变化运用Western-bloth观察到AAV9-hIGF-1减少了PP65的表达,AAV-hIGF-1组为(0.45±0.07%),低于AAV-GFP组(0.76±0.13%),高于正常组(0.38±0.06%),差异有统计学意义。结论:1通过尾静脉注射,AAV9能够在mdx小鼠的多部位表达,其中胫前肌中表达最多。2 AAV9-hIGF-1尾静脉注射治疗能减轻了mdx小鼠肌肉的炎症反应。3推测hIGF-1是通过下调NF-κB信号通路起到抗炎的作用。