柿果实富含营养物质和矿物质,有药用和保健功效,是北方重要的秋冬水果之一。柿属于呼吸跃变型果实,采收后短期内易软烂,致鲜果流通困难,造成严重的经济损失。因此,如何控制果实后熟软化成为柿果贮藏中的关键问题。脂氧合酶能启动植物细胞膜的膜脂过氧化反应,造成细胞膜降解,最终导致果实的成熟软化或叶片的衰老。目前对脂氧合酶的研究主要集中于成熟衰老和胁迫诱导其表达方面,而关于脂氧合酶在果实采后软化和抗逆反应过程中的分子调控机制并没有系统的研究。本文以‘富平尖柿’(Diospyros kaki L.cv.Fuping Jianshi)为试材,探讨了柿脂氧合酶基因在不同组织、果实发育期和采后胁迫处理中的表达模式;并进一步地以转基因番茄和转基因拟南芥为材料,验证了脂氧合酶在衰老和抗逆反应中的功能。主要结果如下:1.以柿不同组织和发育期的果实为材料,探讨LOX基因的表达模式。结果表明:DkLOX1在果实中特异表达,DkLOX4在果实、茎、叶、花和花萼中均表达;DkLOX1和DkLOX4在幼果中表达量较DkLOX3高,且表达高峰与幼果生长双“S”曲线保持一致;DkLOX3在所有组织均表达,在幼果中的表达量较低。这些结果表明DkLOX1和DkLOX4可能与果实的生长发育有关。2.以初熟期的柿果实为材料,探讨经损伤、高二氧化碳、低氧和低温胁迫处理后果实中LOX基因的表达特点。结果表明:与对照相比,高二氧化碳促进DkLOX1的表达,损伤和低温促进DkLOX4的表达;DkLOX1和DkLOX4在其他处理中出现随着果实的成熟衰老表达下降的趋势;DkLOX3的表达量和脂氧合酶的活性在果实采收后显著提高,并且所有处理的DkLOX3表达高峰与乙烯释放峰同步。此外,与对照相比,损伤处理后DkLOX3的表达快速提高并一直保持较高水平,高二氧化碳处理4天时DkLOX3的表达急剧升高后下降并在呼吸跃变前稳定高表达。这些结果表明DkLOX1和DkLOX4可能不参与果实的成熟衰老,而DkLOX3可能在果实的成熟衰老和胁迫响应中起到重要的作用。3.构建DkLOX3-pVBG2307过表达载体,分别得到番茄和拟南芥转基因植株。结果发现,转基因番茄绿熟期的果实在采收后转色速度加快、乙烯释放峰提前、MDA含量提高、乙烯合成关键基因ACS2、ACO1和ACO3的表达量提高;转基因拟南芥离体叶片和整棵植株在黑暗诱导下的衰老加速,伴随着更高的叶绿素降解、电解质渗漏率、丙二醛含量、活性氧积累和细胞死亡比例。这些结果为脂氧合酶在果实成熟软化和叶片衰老中的作用提供了直接的证据。4.转基因拟南芥种子在含有130 mM NaCl和200 mM甘露醇的渗透胁迫培养基上发芽率更高,幼苗的根的生长受到的抑制也较野生型轻。干旱处理下,转基因拟南芥叶片的卷曲程度低于野生型,当恢复浇水后24小时,更多的转基因植株恢复正常生长。盐胁迫处理下,转基因拟南芥幼苗的生长受到的抑制比野生型轻,莲座叶直径大于野生型。干旱和盐胁迫处理下转基因拟南芥积累的O2-和H2O2更少,ABA依赖途径中的正调控基因RD22、RD29B和NCED3表达量上调,负调控基因FRY1表达下调,同时,ABA非依赖途径的正调控基因RD29A表达量也上调。这些结果表明了脂氧合酶可能通过调控活性氧积累和胁迫响应基因的表达来提高了对非生物胁迫的抗性。5.对转基因和野生型拟南芥的离体叶片接种活体营养型菌Pst DC3000,结果表明,过表达DkLOX3的转基因拟南芥提高了对Pst DC3000的抗性。受Pst DC3000侵染后,转基因叶片在12h和24h积累的O2-、H2O2和死细胞数量高于野生型,LOX酶活高于野生型,然而自由基清除酶POD、CAT和SOD的活性较低,出现过敏反应。Pst DC3000侵染后48h和72h,转基因叶片的自由基清除酶POD、CAT和SOD的活性逐渐高于野生型,自由基积累减缓,叶片中菌的扩繁量也低于野生型。此外,转基因拟南芥叶片中的SA含量及其标记基因PR1和PR2的表达显著高于野生型,而转基因叶片中的JA含量及其标记基因PDF1.2的表达与野生型无显著差异。这些结果表明了脂氧合酶可能通过调控ROS的积累和SA合成来提高对Pst DC3000的抗性。6.对转基因和野生型拟南芥的离体叶片接种死体营养型菌-灰霉菌,结果表明,过表达DkLOX3的转基因拟南芥提高了对灰霉菌的抗性。受灰霉菌侵染后,转基因叶片在12h积累的O2-和H2O2高于野生型,自由基清除酶POD、CAT和SOD的活性较低。侵染24h后,转基因叶片的自由基清除酶POD、CAT和SOD的活性较野生型高,自由基积累速度减缓,且逐渐集中在病灶部位,而野生型拟南芥叶片中的自由基快速积累。转基因拟南芥叶片中的SA、JA含量及其标记基因的表达量与野生型相比均无显著差异。这些结果表明了脂氧合酶可能通过调控早期活性氧的积累,但并不通过调控SA或JA代谢途径提高对灰霉菌的抗性。