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典型和非典型肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)的很多特性都不相同,典型EPEC(typical EPEC,tEPEC)除了含有肠细胞脱落位点(locus of enterocyte effacement,LEE)毒力岛外,还含有被称为EPEC黏附因子(EPEC adherence factor,EAF)的质粒,而非典型EPEC(atypical EPEC,aEPEC)仅含LEE毒力岛,不含EAF质粒。tEPEC是发展中国家婴儿发生腹泻的一个首要原因,而发达国家则比较少,似乎aEPEC是更重要的腹泻因素。tEPEC唯一的宿主是人,aEPEC,人和动物都可以成为宿主。aEPEC和tEPEC在遗传特征,血清型与毒力的特性也各不相同。aEPEC和STEC(产志贺毒素大肠杆菌)的遗传关系更为密切,这些菌株似乎是一类新出现的病原体。为了解我国不同来源中aEPEC携带情况,对aEPEC的致病性做进一步的探索,本文开展了以下的研究:(1)建立快速检测粘附与脱落性大肠杆菌的分子生物学方法;(2)对不同来源的aEPEC的感染流行情况进行初步调查研究;(3)对aEPEC可能的相关毒力基因进行检测;(4)利用凝胶脉冲场电泳(PFGE)对分离株进行分析,追溯不同来源的aEPEC菌株间的相互关系。一、黏附与脱落性大肠杆菌的PCR快速检测方法的建立利用PCR方法扩增紧密素eaeA基因来检测细菌的纯培养物,10株黏附与脱落性大肠杆菌(AEEC)的PCR结果呈阳性,而其他大肠杆菌包括非致病性大肠杆菌、肠产毒素大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌和非大肠杆菌均未出现特异性的片段。对PCR扩增的eaeA基因产物经行序列测定,与参考株eaeA序列比对后一致。研究表明该PCR体系能检测出12pg的模板DNA。这表明PCR法对于AEEC的鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作的优点。同时本研究基于EHEC O157:H7 EDL933W株和EPEC株的eaeA、bfpA、stx1、stx2四个基因建立了多重PCR检测方法,可以快速区分出EHEC、tEPEC和aEPEC,为EHEC和EPEC的感染和流行病学调查,提供了一种简便实用的技术手段。二、非典型肠致病性大肠杆菌的流行病学调查为了解我国人源和动物源中aEPEC的携带情况,自2007年6月至2008年8月采集不同来源的样本以增菌培养、选择性培养和PCR方法进行分离鉴定。统计分析表明,在808份医院粪便样品中,检出AEEC阳性140份,阳性率为17.3%。住院部的感染率高于门诊部的。健康人群体检样本2606份,检出阳性样品340份,阳性率为13.0%。在117份生猪屠宰场样品中,47份aEPEC阳性,阳性率为40.2%。奶牛场样品231份,检出aEPEC阳性36份,阳性率15.6%。宠物医院样品42份,检出阳性8份,阳性率为19.0%。家禽市场鸭、鹅样品共464份,阳性23份,平均阳性率4.96%。超市样品599份,阳性21份,阳性率3.5%。从以上结果可以看出,该类细菌具有明显的季节性特征,夏秋季节的检出率明显高于冬春季节,aEPEC在不同群体的流行呈现多样化和复杂化,在鸭中未检测到阳性样本,这可能和宿主特异性有关;猪群的感染率高于人群,加强对猪源aEPEC的控制,有助于预防和控制人腹泻的发生和传播;健康人群中aEPEC携带率也比较高,与国外相关报道基本一致,可能部分aEPEC菌株为非致病菌或为条件致病菌;宠物中携带率亦较高,对于婴幼儿应避免频繁接触宠物;超市样本中,生猪肉和牛肉以及虾中检测到阳性,可能为交叉污染或本身带菌,应加强对生熟食品的加工和存储管理,避免交叉污染。三、非典型肠致病大肠杆菌可能的毒力因子检测分析通过对186株不同来源的aEPEC分离株的相关基因进行检测,以找出毒力基因和致病性之间的联系,为进一步研究非典型EPEC奠定基础。本研究共检测了与致泻大肠杆菌相关的基因escV、astA、ipaH、fyuA、estA、estB、elt,检出率分别为:93.0%、4.3%、0%、30.0%、10.8%、0.5%、0.5%。这些菌株共鉴定出28个血清型:O11、O115、O118、O123、O132、O139、O156、O188、O38、O40、O49、O62、O63、O65、O74、O78、O80、O156、O91、O107、O88、O24、O111、O4、O145、O103、O117、O9,但大部分菌株无法鉴定,这与国外的报道也相一致;对其进行种系发生型分类,A型占38.7%、B1型占53.8%、B2型占3.2%、D型占4.3%,发现我国的aEPEC分离株主要分布于A型和B1型;基因检测显示常见的毒力基因的携带率都较低,这可能和aEPEC特殊的致病机理相关。这些结果为研究aEPEC的毒力特性和致病机理积累了有用的资料。四、不同源非典型肠致病性大肠杆菌分离株PFGE分子亚分型研究47株不同源的非典型EPEC分离株PFGE图谱可分为3个遗传谱系,且我国非典型EPEC分离株中有2株分离株属于遗传谱系Ⅰ,15株属于遗传谱系Ⅱ,30株属于遗传谱系Ⅲ;分别占4.3%、31.9%、63.8%,主要属于遗传谱系Ⅱ和Ⅲ。不同源分离株在谱系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中呈交叉分布。分析表明,健康人群分离株在Ⅰ、Ⅱ谱系中占优势;禽源在遗传谱系Ⅲ中占优势;而腹泻病人主要集中在遗传谱系Ⅱ和Ⅲ;其他分离株在各谱系中均有分布,由此推测猪群和健康人群是aEPEC的主要携带者。根据PFGE进化树图分析,以人源EDL933 O157:H7标准株为参照,分离株C187与其亲缘关系最为接近,而同一克隆亚群内的其他分离株包含了健康人群、腹泻人群、猪群、健康人群、禽源都有分布,从以上结果可以推断:部分可能导致腹泻的aEPEC确实与EHEC有着较高的同源性。分子亚分型研究分析表明,PFGE可作为研究非典型肠致病性大肠杆菌来源和传播途径的有力工具,且PFGE分辨力高,是世界公认的金标准。我国aEPEC不同分离株呈高度交叉分布,人源aEPEC与动物源aEPEC密切相关,可能存在着相同的传染源,而且猪源和禽源可能是人非典型肠致病性大肠杆菌的主要传播途径之一。