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中国林蛙皮肤及其分泌物在中国林蛙抵御外源微生物和病原菌侵袭的过程中起着至关重要的作用。目前对中国林蛙皮肤及其分泌物的研究主要是集中在某个或某几个蛋白或活性多肽上,在整体水平上对中国林蛙皮肤及其分泌物中防御蛋白及多肽的转录及表达水平的研究很少。本实验运用EST技术和蛋白质组学技术,分别从RNA转录水平和蛋白质表达水平两个方面共同对中国林蛙皮肤及其分泌物的免疫防御性蛋白及多肽基因表达进行了研究,期待从整体水平上对两栖类皮肤及其分泌物的功能和它们在免疫防御过程中发挥的作用做一个概述,并为日后中国林蛙皮肤功能基因的筛选奠定基础。首先,我们构建了中国林蛙皮肤cDNA文库,测定EST序列6696条。经过一系列的序列前处理工作后,获得5976条高质量的EST数据。这些高质量的序列经过CAP3聚类拼接后,获得1891个片断重叠群,其中contigs512个,singletons1379个。其次对聚类拼接后的1891条clusters与Genbank中下载的核酸和蛋白数据库进行了序列同源性比对,有46.6%的数据得到了注释,仍有53.4%的基因未能找到同源序列,很有可能为新基因。基因注释的结果显示在中国林蛙皮肤中许多与分泌和免疫防御相关的基因是高表达的,主要包括泛素、凝集素、蛋白酶抑制剂、乳清酸蛋白等。基于Gene Ontology我们将已知的826(43.7%)个clusters按照分子功能,生物学过程和细胞组分三大类进行了分类整理。更进一步地,我们利用InterProScan将1891个clusters与蛋白功能域数据库进行了比对,有638(33.7%)的clusters得到注释。另外,还对中国林蛙皮肤表达基因进行了KEGG代谢途径分析,从而在分子水平上对中国林蛙皮肤生理功能和代谢途径有了进一步的了解。经过对中国林蛙皮肤EST库的分析,我们发现了518条与免疫防御密切相关的ESTs。这些免疫防御相关基因主要包括乳清酸蛋白家族(WAP)、非消化性的酶和酶抑制剂、抗菌肽分子、凝集素等。这些免疫防御相关基因的发现与分析为阐明中国林蛙皮肤免疫防御机制提供了重要的分子信息。此外,我们利用双向电泳和质谱技术对中国林蛙皮肤及其分泌物中的蛋白质表达进行了研究。我们主要发现了脯氨酸-4羟化酶、L-别苏氨酸醛缩酶、半乳糖凝集素、Ranasmurfin、BTB/POZ家族成员蛋白质、巨噬细胞移动抑制因子、抗菌肽chensirin-3前体、以及磷酸甘油酸激酶。它们在中国林蛙皮肤免疫防御过程中均起到重要作用。