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神经干细胞(Neural stem cells, NSCs)是具有自我分裂,自我复制,自我更新及自我维持能力,并具有多种分化潜能的特殊细胞群,无论是在发育中还是成年的哺乳动物神经系统,都有神经干细胞存在。侧脑室附近的室管膜下区和海马是目前公认的哺乳动物神经系统中神经干细胞最为集中的部位,因此,这两个部位成为神经干细胞研究的重点。近年的研究发现,位于室管膜前下区(Anterior subventricular zone, SVZa)的神经干细胞具有特殊的迁移分化特性。首先,SVZa神经干细胞是出生后嗅球(Olfactory bulb, OB)中间神经元终身更新的来源,SVZa神经干细胞产生后,沿着一条高度局限的迁移通道――嘴侧迁移流(Rostral migratory stream, RMS)以首尾相连接的链式(Chain)模式朝嗅球迁移,到达嗅球中央后,朝周边的颗粒细胞层和球周细胞层迁移而到达迁移终点,分化形成颗粒细胞和球周细胞。大约30%的球周细胞属于(-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid, GABA)能神经元,70%的球周细胞属于多巴胺能(Dopaminergic, DA)神经元,它们是中枢神经系统中最大的多巴胺能神经元细胞群之一。与其他部位的神经干细胞相比,SVZa神经干细胞还具有以下特点:(1)自产生时起即具备发育为神经元的特征;(2)迁移过程中保持增殖状态和神经元特征而不进一步分化;(3)到达迁移终点后,才进一步分化为DA能和GABA能神经元。Wnt是wingless(果蝇的无翅基因)与Int(Insert,在小鼠乳腺癌相关病毒基因插入后再被激活)的缩合。Wnt家族是一组分泌型糖蛋白信号分子,目前已知的分子有十几个,Wnt通过与细胞膜上的特异性受体(Frizzled)结合,可以将信号传导到胞内,增加胞浆内游离β-catenin(链蛋白)浓度,后者与转录调控因子协同进入细胞核,调控下游基因的转录。Wnt-1是Wnt家族中被研究得最为广泛的一个发育相关基因,其对神经细胞的成熟与凋亡,神经系统的发育都起着重要调节作用。研究发现,在细胞分化发育过程中,总是伴随着Wnt-1的表达,细胞分化的过程一停止,Wnt-1的表达也随之停止,可见,神经细胞的分化与Wnt-1的表达是密切相关的。其他研究还证实,Wnt-1有利于胚胎干细胞向神经细胞方向分化,同时,Wnt-1还能对抗神经元的凋亡,促使神经前体细胞分化为神经元。在SVZa区NSCs经RMS向嗅球迁移并在嗅球终末分化这一SVZa NSCs所<WP=11>特有的迁移分化过程中,Wnt-1可能起到的调节作用,目前还没有相关研究报道。Pax因编码128个氨基酸的成对结构域(Paired domain)而得名,其蛋白是一类重要的转录调控因子,在胚胎发育过程中对组织和器官的特化起着重要调节作用。Pax-6对神经系统的发育也有重要影响。首先,Pax-6参与调控了脑内神经细胞的迁移。研究证实Pax-6对中脑脊细胞的迁移是必不可少的。Pax-6缺失也将延迟延髓神经元的迁移和定居(settlement)。此外,Pax-6还与脑内多巴胺神经元的发育有密切关系。Pax-6参与调控了丘脑腹侧酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)阳性神经元的发生,Pax-6的低表达也将抑制视交叉上核多巴胺能神经元的发育。嗅球是除中脑外,脑内多巴胺能神经元富集的另一个主要区域,敲除小鼠Pax-6基因会导致神经干细胞自SVZa朝嗅脑迁移的数量减少,嗅脑体积变小,球周细胞层内的TH阳性神经元数量减少。这些结果提示,Pax-6与SVZa NSCs的迁移以及嗅球的发育,尤其与嗅球多巴胺能神经元的发育有密切关系。而目前在SVZa NSCs独特的迁移过程中,Pax-6可能起了怎样的作用,尚未见相关研究报道。有关Pax-6对嗅球多巴胺能神经元发育影响的研究也极少。本实验中,我们以BrdU活体标记胚胎及新生大鼠脑内的增殖细胞,结合抗BrdU、Wnt-1、和GFAP等免疫荧光染色,我们观察到了NSCs从SVZa向嗅球迁移形成神经干细胞迁移流的情况,并对Wnt-1在大鼠发育脑嘴侧神经干细胞迁移流中的时空表达模式进行了初步分析,得到如下结果:1、NSCs自SVZa向嗅球迁移,形成明显的神经干细胞迁移流。2、Wnt-1表达的时间差异:在大鼠SVZa区、RMS主干部分和嗅球三个部位,Wnt-1的表达水平在胚胎14d明显高于出生后0d和7d两个时间点,差异显著,在出生后0d和7d这两个时相点上,Wnt-1的表达水平相似。3、Wnt-1表达的空间差异:在上述三个时相点上,Wnt-1在嗅球的表达都最高,在SVZa区的表达居次,在RMS主干部分的表达量最低。在各时间点上,Wnt-1的表达水平在三个部位之间都存在显著差异。同时,结合抗BrdU、Nestin、Pax-6和GFAP免疫荧光染色,我们比较了在胚胎及新生大鼠脑内,BrdU与Nestin表达的一致性,并对Pax-6在大鼠脑正常发育过程中,于嘴侧神经干细胞迁移流中的时空表达模式进行了初步分析,得到如下结果:1、Pax-6在神经干细胞和少量胶质细胞中均有一定表达,但主要于神经干细胞内表达,在胶质细胞内的表达较少。2、Pax-6在海马增殖细胞中表达水平较高。3、Pax-6在嘴侧神经干细胞迁移流中的表达具有一定时空特点:首先,Pax-6在胚<WP=12>胎14d与出生后0d和1d的表达情况相似,具有较高水平表达,而出生后则迅速降低,到出生后7d,表达量已经很低。其次,在表达的空间分布上,Pax-6在RMS主干部分的表达强于SVZa区和嗅球。4、Pax-6在嗅球僧帽细胞层有高水平表达,明显高于其内侧的颗粒细胞层和外侧的球周细胞层。同时,我们体外