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背景:肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在全球所有恶性肿瘤相关死因中高居第二位。化疗是肝癌非手术治疗最常用的方法,然而目前仍然没有明确的证据表明任何一种化疗方案优于其他方案。由于肿瘤异质性的广泛存在,临床医生在选用化疗方案时往往仅凭个人经验,导致肝癌化疗疗效的不确定性,有关资料显示肝癌经验性化疗的有效率甚至不足30%。在“精准医疗”(precision medicine)模式的推动下,肝癌个体化治疗越来越受到人们的重视。而一系列临床研究也相继证实了肿瘤药敏试验(chemosensitivity test,CST)对于肝癌个体化治疗具有重要的指导意义。然而,由于缺乏高级别的临床证据,人们对肿瘤药敏试验应用于临床实践依旧持谨慎的态度。传统的肝癌药敏试验大多采用二维培养法,不能很好地模拟肿瘤细胞在体内的微环境,使得药敏试验结果无法真实反映肝癌患者对化疗药物的敏感性。另一方面,肝癌药敏试验缺乏统一的技术标准,各研究中心的药敏结果评判标准各不相同,极大地限制了肝癌药敏试验的推广。鉴于此,一种基于三维培养系统的、采用准确可靠的药敏评判标准的药敏试验方法是肝癌个体化治疗未来的一大研究方向。目的:发明一种成本较低、简单易行、稳定可靠的三维药敏试验方法,为肝癌个体化化疗提供重要指导。方法:第一章三维培养系统的构建与评价以商品化的三维培养系统GravityPLUS和AggreWell为借鉴设计模具,并用SOLIDWORKS 2016软件绘制倒模图,通过应用3D打印技术和注塑法构建三维培养系统。然后用三维培养系统对C3A细胞进行聚球培养,同时以二维培养组作为对照,动态观察两组细胞的形态学变化及检测其白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、乳酸脱氢酶(LDH)水平。第二章人原代肝癌细胞的三维药敏试验采用胶原酶消化法和Percoll密度梯度离心法分离和纯化人原代肝癌细胞,并用台盼蓝拒染法和免疫荧光染色进行计数和鉴定。用第一章构建的三维培养系统对分离得到的人原代肝癌细胞进行聚球培养,同时以二维培养组作为对照,动态观察两组细胞的形态学变化。最后分别用八种化疗方案处理两组细胞,并用CCK-8法检测细胞活力,通过敏感度分级、敏感指数和联合指数三个指标对药敏结果进行综合评价。结果:第一章三维培养系统的构建与评价制作的PDMS模具具有良好的均一性,微孔均呈球形,无明显锯齿化。C3A细胞在接种三天后即可聚集成球,细胞球直径因接种密度而异,最终可占满整个微孔达到400μm。对C3A细胞的功能动态检测显示三维培养组的ALB、BUN水平明显高于二维培养组,反映三维培养组的合成功能和解毒功能优于二维培养组;而作为肝功能损害敏感指标的ALT、AST和LDH水平三维培养组总体低于二维培养组。第二章人原代肝癌细胞的三维药敏试验成功分离的两例人原代肝癌细胞活率和纯度分别大于90%和85%。两例人原代肝癌细胞在接种至三维培养系统三天后即可聚集成球,且绝大多数散在细胞均能迁移至微孔中,成球效果明显优于C3A细胞。药敏结果显示,对于第一例人原代肝癌细胞(ID:2652968),二维培养组对ADM+DDP的联合方案最敏感,而三维培养组对八种方案均耐药;对于第二例人原代肝癌细胞(ID:2685241),二维培养组对ADM+DDP的联合方案最敏感,而三维培养组对GEM+OXA最敏感。结论:本课题通过应用3D打印技术和注塑法构建的三维培养系统优于传统二维培养系统,尤其适合人原代肝癌细胞的聚球培养。结合CCK-8法和敏感度分级、敏感指数及联合指数三个指标能够很好地评价人原代肝癌细胞对不同药物的敏感性。在我们的实验中,人原代肝癌细胞二维及三维药敏结果存在较大差异,三维培养组对同一化疗方案的敏感性普遍低于二维培养组,与文献报道相符。该肝癌三维药敏试验方法具有成本低廉、操作简便、可重复利用、成球效果良好、适合高通量药物筛选等优点,提高了检测的准确性和稳定性,能够更合理地指导临床科学用药,为肝癌个体化治疗提供重要参考。