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三萜是一种重要的代谢产物,广泛分布于植物界中,具有抑制真菌和细菌生长、抵御虫害、使动物拒食及抗癌等生理活性。2,3-氧化鲨烯的环化是甾醇和三萜合成的分支点,参与该环化事件的酶类为2,3-氧化鲨烯环化酶(OSC)。近年来,对OSC的研究在多种植物中都取得了进展。通过酵母异源表达体系,已经鉴定出拟南芥(Arabidopsisthaliana)中13个OSC和水稻(Oryzasativa)中4个(3个未鉴定)OSC的催化产物。然而,目前对OSC在植物体内的功能研究却十分缺乏,因此,对植物体内OSC代谢途径的研究必然成为今后的热点。核酸序列进化树分析表明OSC基因具有物种特异性,不同物种的OSC基因功能差异较大;其中一个未知功能的分支包括了OsOSC8与其它单子叶植物的同源基因,其蛋白质序列非常保守,水稻亚种、野生稻之间的OsOSC8基因的Ka/Ks均远小于1,表明OsOSC8可能具有重要的功能。
本实验重点开展了OsOSC8蛋白表达的组织特异性以及基因同源性分析。我们首先制备了一系列OsOSC8单克隆抗体,筛选到特异性最强的一份用于后续试验;然后Western blot实验证明水稻OsOSC8仅在花药中表达,而在内稃、外稃和雌蕊中都没有表达,表明该基因必定在花药的发育过程中有重要作用。通过免疫组织化学实验,我们对OsOSC8进行组织定位,结果显示在二分体时期,OsOSC8在花药的药室内壁细胞和中层细胞中积累;在小孢子游离时期,绒毡层和小孢子中有少量的OsOSC8;至小孢子液泡化后期,绒毡层细胞降解后释放出来的OsOSC8蛋白聚集在一起,药室内壁细胞不再积累OsOSC8;最后,在花粉粒成熟时,可见花粉粒上含有大量的OsOSC8蛋白。此外,我们还克隆了禾本科高粱、玉米和小麦中的OsOSC8同源基因,氨基酸序列比对发现这四个基因的同源性在80%以上,推测它们可能具有相同或相似的生理功能。Westernblot结果表明大麦、玉米和文殊兰等单子叶植物的花药中存在同源基因表达,而茄子和含笑等双子叶植物中没有OsOSC8的同源蛋白。由此,我们确信OsOSC8及其同源基因为单子叶植物特有,在植物体内发挥着重要的生理功能。