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目的:采用HULTH造模方法构建新西兰大白兔骨关节炎动物模型,续断总皂苷进行干预,进而观察软骨组织形态、病理变化及炎症因子表达,同时利用续断总皂苷在体外干预软骨细胞凋亡与增殖及其相关凋亡蛋白表达,从而了解续断总皂苷在治疗骨关节炎模型的作用机制。方法:取28只新西兰大白兔,分别每组设立7只,随后随机分为4组:分别是正常组、模型组、阳性对照组(美洛昔康)、治疗组。利用构建新西兰大白兔骨关节炎模型,然后在模型成功后1周对新西兰大白兔连续给药6周,再对新西兰大白兔骨关节炎的病理及相关炎性细胞因子进行检测。(1)对各实验组的软骨组织进行收集,并且进行制作切片,然后观察细胞形态学及软骨组织病理的变化。(2)收集关节腔内关节液或者关节囊,然后采用ELISA法检测关节液中TNF-α,IL-1β,PGE2和IL-6的含量。(3)利用Western blot技术检测各组关节软骨中MMP-3和MMP-1的蛋白表达含量。(1)通过利用续断总皂苷从而达到促进软骨细胞生长的实验研究:利用新西兰大白兔软骨进行消化,从而获得软骨细胞,得到的软骨细胞进行培养,利用第3代软骨细胞进行实验。然后利用显微镜观察软骨细胞的形态,利用免疫组化鉴定软骨细胞及分化能力。实验可以分为:高剂量组(续断总皂苷终浓度为100ug/L)、中剂量组(续断总皂苷终浓度为50ug/L)、低剂量组(续断总皂苷终浓度为25ug/L)、对照组(续断总皂苷终浓度为Oug/L)。在作用72h后,然后利用MTT检测各组细胞的增殖能力,了解各组软骨细胞周期的分布。Western-blot检测各组细胞中p21、CDK4、cyclinD1蛋白的表达。(2)通过利用续断总皂苷从而抑制软骨细胞调亡的实验研究:利用第3代软骨细胞进行实验。实验分为:对照组、不加药的模型组、低剂量、中剂量、高剂量,其中对照组加含10%胎牛血清的的DMEM培养基,其余各组均加入含有1 mmol/L SNP的10%胎牛血清的DMEM培养基。Western-Blot检测各组软骨细胞凋亡因子 Bcl-2、Bax、NF-κB、Caspase-3、Caspase-9 蛋白表达。RealtimePCR法检测各组细胞中Caspase-3、Caspase-9MRNA表达。ELISA法检测细胞上清液中 IL-1β,IL-6,TNF-α 和 PGE2 含量。结果:1、通过体内实验结果得知:正常组可以看到软骨组织表面光滑,软骨细胞分布均匀。而模型组软骨组织则受到一定的破坏;治疗组软骨表面裂隙较少,软骨组织损伤有所减轻。EIISA检测关节滑液中TNF-α,IL-6,PGE2和IL-1β的含量结果表明:与正常组相比,模型组关节滑液中TNF-α,IL-6,PGE2和IL-1β表达量明显升高(P<0.01);与模型组相比,治疗组关节滑液中TNF-α,IL-6,PGE2和IL-1β表达量明显降低。Western-blot结果表明:与正常组相比,模型组中MMP-3、MMP-1蛋白含量显著提高(P<0.01);与模型组相比,治疗组关节软骨中MMP-3、MMP-1蛋白含量显著降低(P<0.01)。2、体外实验结果:细胞形态结构研究:软骨细胞鉴定:细胞染成蓝紫色,细胞呈梭形,细胞核染成紫红色的,根据流式鉴定结果该细胞符合间充质干细胞表型特征。软骨细胞诱导分化:软骨细胞在诱导14天后,细胞就会呈现出向成骨细胞分化的趋势,就会发现呈梭状生长,并且会出现重叠排列,通过茜素红染色结果发现细胞会呈现出朱红色,有钙化灶结节出现。利用续断总皂苷从而会促进软骨细胞增殖的研究:结果表明,利用续断总皂苷后能够显著的促进骨关节炎软骨细胞增殖,并呈剂量依赖性。细胞周期分布及细胞周期蛋白表达.:与对照组相比,中、高剂量组的G0/G1期明显降低(P<0.01),G2/M期则则会出现明显升高的情况(P<0.05)。在通过干预72h后,与模型组相比,高、中剂量组的CDK4和CyclinD1蛋白的表达会显著升高(P<0.05);与对照组相比,中、高剂量组中p21的蛋白表达明显降低(P<0.05)。续断总皂苷抑制软骨细胞凋亡的研究:与模型组相比,低、中、高剂量组中Bax蛋白表达明显下降(P<0.05);Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05),且NF-κB表达同样有该特点,中、高剂量表达低于模型组(P<0.05)。与模型组相比,低、中、高剂量的Caspase-9、Caspase-3蛋白表达明显下降;RealtimePCR结果表明,低、中、高剂量组中Caspase-3、Caspase-9mRNA表达量明显低于模型组。与模型组比,低、中、高剂量组的IL-1β,IL-6,PGE2 和 TNF-α 表达量明显降低(P<0.05)。结论:1、续断总皂苷可以延缓OA模型中软骨组织退变,与IL-1β,IL-6,TNF-α和PGE2分泌,降低MMP-1及MMP-3表达有关。2、续断总皂苷能够促进软骨细胞的增殖,且是通过增强细胞周期蛋白CyclinD1、CDK4表达,而抑制p21表达,并缩短细胞周期G0/G1期实现的。3、续断总皂苷能抑制SNP诱导的软骨细胞凋亡,是通过抑制炎性细胞因子和凋亡相关蛋白表达实现的。