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研究背景1型糖尿病（T1D）是自身免疫性疾病,以T淋巴细胞（包括CD4+和CD8+T细胞）介导、巨噬细胞浸润,最终导致胰岛β细胞自身免疫性破坏。同时,胰岛β细胞凋亡对糖尿病的发生发展也起重要作用。T1D占糖尿病总患病率的10%,近年来发病率逐年上升,据报道全球患病率以每年3%的速度增长,预计2010年将比1998年的患病率增加40%。T1D病理改变主要是胰岛β细胞大量破坏、胰岛素分泌严重不足,临床表现为高血糖和酮症酸中毒,临床确诊时胰岛β细胞至少80%遭到破坏。目前对T1D的治疗首选胰岛素替代治疗,尽管精密准确的血糖检测系统得到广泛的应用,并且研制开发出许多胰岛素的新型制剂,但是绝大多数的糖尿病患者仍然避免不了不可逆并发症的发生,严重影响患者的生活质量。许多临床研究建议通过胰岛素强化治疗达到严格血糖控制,期望杜绝或延缓糖尿病并发症的发生,但最终结果并非如此。因为,外源性胰岛素替代不能达到胰岛分泌的内源性胰岛素对内环境稳定的精确调控。于是又开展胰岛移植,可以达到近乎生理性的血糖水平,避免胰岛素强化治疗伴发的低血糖危险。由于有效胰岛的分离技术不成熟以及胰岛离体后死亡问题一直未得到解决,也限制胰岛移植的开展应用。胰腺移植较胰岛移植能够更好、更长期维持生理性血糖调控,因此较胰岛移植应用更广泛。但是,由于器官组织供体的缺乏,以及需要长期应用免疫抑制剂,两种移植治疗都作为糖尿病患者终末期治疗的选择方案。因此,开发其他的治疗战略,达到恢复功能性胰岛组织,迫在眉睫,自身胰岛β细胞再生成为新的研究热点。胰岛β细胞是体内唯一能够根据血糖水平合成和分泌胰岛素的细胞。胰岛β细胞的发生至少经过两个途径：已分化β细胞的复制和β细胞再生。在胎儿期胰腺发生过程中这两条途径都存在；然而成年后,通过β细胞有丝分裂增生仅占β细胞总数的0.5-6%,因此体内胰岛β细胞增生主要来自已经存在的分化β细胞的复制。营养素（如葡萄糖）和某些生长因子（包括胰岛素样生长因子1和生长激素）可以诱导β细胞复制,并且明显增大胰岛β细胞的体积。胰岛β细胞的发生和存活受控于生长因子,特别是胰岛素样生长因子（IGFs）,包括两种成分：IGF-1和IGF-2。IGF-1具有胰岛素样的代谢调节作用以及刺激细胞组织增殖和分化,循环中的IGF-1主要来自肝脏,由生长激素调节其合成；另外许多组织通过自分泌、旁分泌方式发挥促生长作用。人类和啮齿类动物β细胞有IGF-1受体,对IGF-1刺激有应答。除了促生长作用外,IGFs特别时IGF-1还具有抗凋亡作用,例如在骨髓造血干细胞、神经原细胞、心肌细胞以及各种类型的肿瘤细胞等均发现IGF一1的抗凋亡作用。同时,胰腺局部微环境对胰岛β细胞的生存、死亡,以及β细胞对损伤因子的易感和抵抗能力起决定性的作用。大量干细胞分化研究证实,一些成年组织受损后不能再生,不是由于该组织中缺乏有再生能力的干细胞,而是缺乏有利于干细胞分化、再生及维持机能的微环境。近年来运用基因重组技术和转基因技术,将目的基因转入靶细胞,使靶细胞组织局部高表达目的基因已成为现实。胰岛β细胞局部表达细胞因子IGF-1将有助于保护胰岛β细胞功能和促进胰岛β细胞存活再生,IGF-1可能具有防治1型糖尿病的作用。目的本研究首先利用腺病毒载体构建携带大鼠胰岛素样生长因子IGF-1的重组腺病毒（Ad-rIGF-1）,检测重组腺病毒滴度、目的基因是否有效合成和表达,Ad-rIGF-1是否能够转染鼠胰岛β细胞。链脲佐菌素（STZ）具有选择性破坏胰岛β细胞的作用,被广泛用于建立糖尿病动物模型,在体外研究中诱导胰岛β细胞损害。Ad-rIGF-1转染鼠胰岛β细胞后,利用STZ诱导β细胞破坏,观察鼠胰岛β细胞的胰岛素释放功能、细胞存活率以及细胞凋亡,探讨STZ诱导鼠胰岛β细胞破坏的机制,以及rIGF-1对胰岛β细胞的保护机制；为下一步rIGF-1防治1型糖尿病的动物实验、IGF-1作为候选基因用于1型糖尿病的防治,提供实验基础和理论基础。方法1、重组腺病毒载体的构建和鉴定,重组腺病毒的包装、扩增及滴度测定取鼠肝脏组织,TRIZOL一步法提取总RNA,cDNA第一链合成采用逆转录试剂盒,以其为模板,PCR反应扩增rIGF-1 cDNA.RT-PCR纯化产物和pAdTrack-CMV分别经BglⅡ和EcoRⅤ双酶切,凝胶回收酶切产物,经T4DNA连接酶过夜连接。反应产物转化感受态的大肠杆菌JM109,卡那霉素平板筛选阳性克隆扩增培养,正确克隆命名为pAdTrack-rIGF-1,送上海生工测序。将正确重组pAdTrack-rIGF-1穿梭质粒经PmeI酶切,完全线形化后转化包含腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183,进行同源重组。卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆,鉴定正确的重组腺病毒质粒命名为pAd-rIGF-1.pAd-rIGF-1质粒经PacⅠ酶切,在脂质体Lipofectamine2000介导下转染293细胞。转染后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,第7天在出现明显细胞病变效应后收集病毒,命名为Ad.rIGF.1.同样条件包装扩增不含目的基因的空腺病毒载体,作为病毒载体对照,命名Ad.eGFP.测定病毒滴度。2、转染RINm-5F细胞目的基因表达的检测RINm-5F细胞于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中,置37℃、5%的CO2培养箱中培养。当细胞80%汇合时,以约1×106pfu／ml的Ad.rIGF.1.Ad-eGFP直接转染,培养48h,之后进行下列实验检测。3、转染细胞目的基因和产物的检测①RT-PCR:收集转染后RINm.5F细胞,Trizol一步法提取细胞总RNA,以DNase酶消化去除DNA污染,RT-PCR扩增目的基因片段。②ELISA：收集上述细胞培养液上清,ELISA法检测目的基因的表达。③Vestern blotting:转染48h后裂解细胞,以SDS-PAGE分离蛋白,一抗为羊抗鼠IGF-1特异多克隆IgG,辣根过氧化物酶标记的单克隆抗羊IgG为二抗进行Westernblotting分析.4、胰岛素释放试验和NO测定6个实验组（对照组、STZ组、Ad-IGF-1组、Ad-IGF-1+STZ组、Ad-eGFP组、Ad-eGFP+STZ组）,分别加入含有终浓度为0和／或1.5mmol/LSTZ的培养液,培养24h。收取培养上清液,Griess反应测NO；以不含血清的RPMI 1640培养液清洗细胞2遍,加入含10%FBS的RPMI1640培养液培养24h；不含血清的RPMI 1640培养液清洗细胞后,加入含终浓度16.7mmol/L葡萄糖、0.2%BSA的无血清1640培养液,37℃培养60min,取培养上清检测胰岛素。5、RINm-5F细胞凋亡的检测如上所述的6个实验组,待病毒转染和STZ处理相应组后,用含0.25%胰酶和0.2%EDTA的消化液消化并吹散细胞,计数5×105个细胞以PBS洗涤收集,70%冰预冷乙醇固定,PI避光染色,上流式细胞仪检测细胞凋亡率。6、细胞存活率分析RINm-5F接种96孔培养板,每孔1×105个细胞,培养24h后,细胞处理方式同前,之后弃去培养液,加入lmg/ml MTT于37℃孵育3h,弃去MTT加入二甲亚砜,振摇15min,取490nm测定光密度值,计算细胞存活率。细胞存活率是以对照组细胞存活率为100%,实验各组细胞存活率=（各实验组OD均值／对照组OD均值）×100%。结果1、成功构建重组腺病毒RT-PCR合成rIGF-1 cDNA产物,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析可见约406bp清晰的电泳条带。构建的pAdTrack-rIGF-1穿梭质粒,以BglⅡ和EcoRⅤ双酶切经琼脂糖凝胶电泳分析,得到406bp和9200bp 2个片段,与预期值相符；测序结果与GenBank报道一致。重组腺病毒载体pAd-rIGF-1经PacⅠ酶切后,电泳可观察到一条大的DNA片段（约31kb）和一条较小的DNA片段（4.5kb）。经PacⅠ酶切线形化的pAd-rIGF-1和pAd-eGFP分别转染293细胞,16h后荧光显微镜见到GFP的表达。快速腺病毒感染法滴度检测,Ad-rIGF-1滴度：4.0X108pfu/ml; Ad-eGFP滴度：8.5X108pfu/ml。2、Ad-rIGF-1转染RINm-5F细胞目的基因表达的检测①RT-PCR:Ad-rIGF-1转染RINm-5F的细胞,提取细胞RNA经DNase酶消化后,扩增得到406bp目的条带,Ad-eGFP转染细胞和对照组RINm-5F细胞没有目的条带。②ELISA:Ad-rIGF-1转染RINm-5F细胞48h,收取培养上清,ELISA法测鼠rIGF-1蛋白,71.60±10.33ng/ml,对照组RINm-5F细胞和Ad-eGFP转染细胞培养上清中未检测到该蛋白表达。③Western blotting:转染Ad-rIGF-1的RINm-5F细胞有特异性rIGF-1条带,对照组RINm-5F细胞和Ad-eGFP转染细胞无此特异性条带。以上结果证明重组腺病毒Ad-rIGF-1能够有效转染RINm-5F细胞,目的基因能够在转染后RINm-5F细胞有效合成和释放。3、rIGF-1对STZ作用大鼠胰岛β细胞分泌胰岛素的影响对照组、Ad-rIGF-1和Ad-eGFP转染RINm-5F细胞胰岛素释放量差异无显著性（P>0.05）；STZ作用后,明显降低RINm-5F细胞和Ad-eGFP预处理组RINm-5F细胞胰岛素释放量（P<0.01）,而Ad-rIGF-1预处理组与对照组胰岛素释放量差异无显著性（P>0.05）。4、培养上清中NO含量测定结果对照组、Ad-rIGF-1和Ad-eGFP转染RINm-5F细胞组培养上清NO差异无显著性（P>0.05）；STZ作用后,STZ组和Ad-eGFP预处理组RINm-5F细胞NO产量明显高于对照组（P<0.05）；而Ad-rIGF-1预处理组能明显抑制NO的产生,并与对照组差异无显著性（P>0.05）。rIGF-1能够阻止STZ诱导的NO产生和释放。5、rIGF-1对胰岛β细胞凋亡的影响STZ组、Ad-eGFP+STZ组RINm-5F细胞凋亡率较对照组明显增加（P<0.01）；经Ad-rIGF-1预处理的Ad-IGF-1+STZ组,可有效抑制STZ致细胞凋亡作用,细胞凋亡率与对照组无显著性差异（P>0.05）。6、rIGF-1对胰岛β细胞存活率的影响STZ组、Ad-eGFP+STZ组RINm-5F细胞存活率较对照组明显降低（P<0.01）；而经Ad-rIGF-1预处理的Ad-IGF-1+STZ组,RINm-5F细胞则可抵抗STZ的细胞毒性作用,细胞存活率与对照组无显著性差异（P>0.05）. IGF-1可以明显提高细胞存活率。结论1、本研究成功构建了高效表达大鼠胰岛素样生长因子1的重组腺病毒；2、从分子水平证明重组腺病毒Ad-rIGF-1能够有效表达；3、表达产物具有良好的生物学活性；4、大鼠胰岛β细胞局部高表达rIGF-1能保护细胞功能,即胰岛素合成释放活性；5、大鼠胰岛β细胞局部高表达rIGF-1能抑制链脲佐菌素引起细胞一氧化氮产生；6、大鼠胰岛β细胞局部高表达rIGF-1能保护胰岛β细胞免于诱导凋亡因子的损害；7、大鼠胰岛β细胞局部高表达rIGF-1能提高细胞存活力和存活率；8、STZ诱导胰岛β细胞功能损害、细胞凋亡及降低细胞活性和存活率与自由基一氧化氮介导有密切关系；9、RINm5F细胞可以作为糖尿病胰岛β细胞功能研究的有利工具；10、IGF-1基因可以作为防治1型糖尿病重要的候选基因之一。