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苎麻纤维是最好的天然植物纤维,其纤维最长、强度大,具有吸湿透气、防霉耐磨等多种功能,使苎麻纤维织物在国内外高端市场广受欢迎.苎麻纤维是由苎麻韧皮脱胶获得,习惯将苎麻纤维以外的果胶、半纤维素和木质素等成分统称为胶质.对比目前普遍使用的高温强碱脱胶工艺,生物脱胶能大幅节能减排,并显著提高纤维品质,是目前的研究重点和难点.本课题组前期筛选获得苎麻高效脱胶菌株胡萝卜软腐果胶杆菌PectobacteriumcarotovorumHG-49,其脱胶率达82.2%,去除了苎麻韧皮中95%果胶、70%半纤维素,残留的主要胶质为半纤维素,仍需一定量的碱进行高温碱煮才能去除,分析发现残胶中的甘露聚糖含量较高.为了进一步提高P.carotovorumHG-49脱胶效果,减少碱的用量和高温能耗,本研究对降解甘露聚糖的关键半纤维素酶进行了筛选和脱胶效果评价,并构建相应的高效工程菌,以期显著提高脱胶效果,取得的主要研究结果如下:
(1)筛选鉴定并高效表达了苎麻脱胶关键酶—甘露聚糖酶(ManB),发现该酶与P.carotovorumHG-49协同脱胶能提高苎麻韧皮的半纤维素去除率.依据苎麻半纤维素中甘露聚糖含量较高的特征,以及P.carotovorumHG-49脱胶过程中监测pH变化由中性逐渐升高至碱性,确定以耐碱的甘露聚糖酶为关键半纤维素酶的筛选目标.对已发表的甘露聚糖酶进行了筛选,获得一种能特异性水解甘露聚糖的耐碱典型甘露聚糖酶.对该酶的密码子进行优化,使其适用于毕赤酵母表达系统,合成优化后的酶基因序列并命名为ManB(GenBankaccessionNo.KJ806638.1).构建了高产重组菌株6×ManB-P.pastorisGS115,并在30L发酵罐中高密度发酵后,上清液中酶活力达1649IU/mL,蛋白质浓度达3.34g/L.ManB的最适反应温度为70-75℃,最适反应pH为7-9,在pH6-10能够维持稳定.ManB对角豆胶和魔芋粉水解活力最高,比活力分别为494.0IU/mg和152.8IU/mg.将不同浓度的ManB与P.carotovorumHG-49联合使用对苎麻韧皮进行原位脱胶处理,发现添加400IU/mLManB时苎麻韧皮脱胶率提高到85.6%.
(2)分析P.carotovorumHG-49基因组中糖苷水解酶,发现了一种能显著提高苎麻韧皮脱胶效果且具有较高甘露聚糖酶活性的酶(Cel5M),并鉴定了该酶的特性和功能.通过分类注释P.carotovorumHG-49基因组中所有糖苷水解酶,仅发现一种N端催化域分类于糖苷水解酶第五家族(GH5)、C端分类于碳水化合物第三家族(CBM3)的酶具有较高甘露聚糖酶活力,尤其是对以葡甘聚糖为主的魔芋粉水解活性最高,故命名为葡甘聚糖酶Cel5M(GenBankaccessionNo.MH544226.1).利用重组酶Cel5M与P.carotovorumHG-49联合脱胶,发现添加400IU/mLCel5M时脱胶率提高至88.9%,特别是,半纤维素去除率显著提高.Cel5M最适反应温度为65℃,最适反应pH为6.5,在pH5.0-9.0能够维持较高的稳定性.该酶具有较宽广的底物水解谱,对魔芋粉、羧甲基纤维素钠、木聚糖、角豆胶和瓜尔豆胶等水溶性底物均具有较高的水解活力,比活力依次为1061.1IU/mg、647.3IU/mg、563.4IU/mg、315.1IU/mg和297.1IU/mg.以魔芋粉作为底物时,Cel5M的热稳定性与酸碱耐受性较高.另外,Cel5M的CBM3能显著提高催化域的比活力,并降低对金属离子等的敏感性.
(3)以P.carotovorumHG-49为表达受体,构建了过表达工程菌,提高了苎麻韧皮脱胶效果.将携带信号肽的Cel5M基因与载体pUC18-YJ重组后,转化原始菌P.carotovorumHG-49,获得Cel5M的组成型表达工程菌.分析比较工程菌与原始菌分别在富营养条件下和苎麻脱胶过程中的生长状态和酶活力,发现工程菌具有明显的生长和产酶优势.工程菌将脱胶率由原始的82.2%提高到87.7%,提高了苎麻韧皮的脱胶效果.
本研究发现甘露聚糖酶能显著提高P.carotovorumHG-49苎麻脱胶效果,通过构建同源过表达Cel5M的高效脱胶工程菌,大幅降低了苎麻生物脱胶过程中半纤维素的残留,促进了苎麻生物脱胶绿色技术的应用.
(1)筛选鉴定并高效表达了苎麻脱胶关键酶—甘露聚糖酶(ManB),发现该酶与P.carotovorumHG-49协同脱胶能提高苎麻韧皮的半纤维素去除率.依据苎麻半纤维素中甘露聚糖含量较高的特征,以及P.carotovorumHG-49脱胶过程中监测pH变化由中性逐渐升高至碱性,确定以耐碱的甘露聚糖酶为关键半纤维素酶的筛选目标.对已发表的甘露聚糖酶进行了筛选,获得一种能特异性水解甘露聚糖的耐碱典型甘露聚糖酶.对该酶的密码子进行优化,使其适用于毕赤酵母表达系统,合成优化后的酶基因序列并命名为ManB(GenBankaccessionNo.KJ806638.1).构建了高产重组菌株6×ManB-P.pastorisGS115,并在30L发酵罐中高密度发酵后,上清液中酶活力达1649IU/mL,蛋白质浓度达3.34g/L.ManB的最适反应温度为70-75℃,最适反应pH为7-9,在pH6-10能够维持稳定.ManB对角豆胶和魔芋粉水解活力最高,比活力分别为494.0IU/mg和152.8IU/mg.将不同浓度的ManB与P.carotovorumHG-49联合使用对苎麻韧皮进行原位脱胶处理,发现添加400IU/mLManB时苎麻韧皮脱胶率提高到85.6%.
(2)分析P.carotovorumHG-49基因组中糖苷水解酶,发现了一种能显著提高苎麻韧皮脱胶效果且具有较高甘露聚糖酶活性的酶(Cel5M),并鉴定了该酶的特性和功能.通过分类注释P.carotovorumHG-49基因组中所有糖苷水解酶,仅发现一种N端催化域分类于糖苷水解酶第五家族(GH5)、C端分类于碳水化合物第三家族(CBM3)的酶具有较高甘露聚糖酶活力,尤其是对以葡甘聚糖为主的魔芋粉水解活性最高,故命名为葡甘聚糖酶Cel5M(GenBankaccessionNo.MH544226.1).利用重组酶Cel5M与P.carotovorumHG-49联合脱胶,发现添加400IU/mLCel5M时脱胶率提高至88.9%,特别是,半纤维素去除率显著提高.Cel5M最适反应温度为65℃,最适反应pH为6.5,在pH5.0-9.0能够维持较高的稳定性.该酶具有较宽广的底物水解谱,对魔芋粉、羧甲基纤维素钠、木聚糖、角豆胶和瓜尔豆胶等水溶性底物均具有较高的水解活力,比活力依次为1061.1IU/mg、647.3IU/mg、563.4IU/mg、315.1IU/mg和297.1IU/mg.以魔芋粉作为底物时,Cel5M的热稳定性与酸碱耐受性较高.另外,Cel5M的CBM3能显著提高催化域的比活力,并降低对金属离子等的敏感性.
(3)以P.carotovorumHG-49为表达受体,构建了过表达工程菌,提高了苎麻韧皮脱胶效果.将携带信号肽的Cel5M基因与载体pUC18-YJ重组后,转化原始菌P.carotovorumHG-49,获得Cel5M的组成型表达工程菌.分析比较工程菌与原始菌分别在富营养条件下和苎麻脱胶过程中的生长状态和酶活力,发现工程菌具有明显的生长和产酶优势.工程菌将脱胶率由原始的82.2%提高到87.7%,提高了苎麻韧皮的脱胶效果.
本研究发现甘露聚糖酶能显著提高P.carotovorumHG-49苎麻脱胶效果,通过构建同源过表达Cel5M的高效脱胶工程菌,大幅降低了苎麻生物脱胶过程中半纤维素的残留,促进了苎麻生物脱胶绿色技术的应用.