粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是一种非常重要的促进造血细胞分化和调节免疫功能的细胞因子，它主要由T、B淋巴细胞、巨噬细胞等分泌产生，并且具有很多的生物功能，它能促使粒细胞、单核细胞进行分化和增殖并能产生集落。该细胞因子尤其促进树突细胞的前体细胞的分化，并促使树突状细胞（DC）、单核细胞等抗原提呈细胞集中到抗原注射的部位。因此，GM-CSF作为新一代的高效分子免疫佐剂具有巨大的应用潜力和发展前景。本试验将猪GM-CSF（pGM-CSF）基因在干酪乳杆菌表达系统中分泌表达，然后将pGM-CSF与猪伪狂犬病活疫苗联合使用，分析评价其对疫苗免疫效果的影响。本研究通过合成pGM-CSF基因，并设计引物，扩增得到去除信号肽的pGM-CSF基因，基因全长为396bp，以pET30b作为表达载体，构建了重组表达质粒pET30b-pGM-CSF，并转入大肠杆菌中，IPTG诱导表达pGM-CSF蛋白，经SDS-PAGE与Western blot分析，表达蛋白大小约23ku，主要以包涵体形式存在。为获得可溶性表达，将质粒pET30b-pGM-CSF与分子伴侣pG-KJE8共同转化E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后，利用Ni-NTA对可溶性蛋白进行纯化。通过外周血单个核细胞（PBMC）增殖试验、单核细胞增殖试验和集落形成试验，分析其生物活性，结果显示，pGM-CSF蛋白对PBMC和单核细胞具有明显的刺激其增殖的生物功能。将pGM-CSF基因定向插入到乳酸杆菌表达载体pPG-2中，构建了分泌表达型重组乳酸菌载体pPG-2-pGM-CSF/L.casei393。经1%乳糖诱导表达，Western blot结果显示，表达的上清蛋白能与猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子单抗特异性结合，表明成功获得了目的蛋白的分泌表达。通过对促PBMC和单核细胞增殖的生物学活性检测，结果显示，干酪乳杆菌表达的pGM-CSF具有良好的生物学活性，能够促进PBMC和单核细胞的体外增殖。为进一步研究pGM-CSF的免疫佐剂作用，将重组菌诱导表达后，浓缩培养上清，以四种不同浓度（100μg、50μg、25μg、12μg）与猪伪狂犬病活疫苗联合免疫小鼠，同时设PBS对照组、单独疫苗组和疫苗与pPG-2/L.casei393联合免疫组。分别在注射疫苗前3d和注射疫苗后3d在同一注射部位注射pGM-CSF；并于免疫前和免疫后第4d、7d、10d、14d采集小鼠血清，利用间接ELISA方法检测免疫后特异性抗体水平，结果表明，疫苗与pGM-CSF联合免疫组抗体水平均高于单独疫苗组。在不同浓度pGM-CSF的联合免疫组中，50μg组抗体水平要明显高于其他三组，且与单独疫苗组相比差异极显著（p<0.01），25μg组与单独疫苗组相比差异显著（p<0.05）。同时通过细胞中和试验检测抗体的中和效价，单独疫苗组血清抗体中和猪伪狂犬病毒效价为1：44.36，疫苗与pPG-2/L.casei393联合免疫组抗体中和效价为1：46.3，疫苗与pGM-CSF联合免疫组的抗体中和效价为1：62.5。使用MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况，结果显示，在低浓度（1μg/mL）和中浓度（5μg/mL）抗原的刺激下，疫苗与pGM-CSF联合免疫组的脾淋巴细胞增殖刺激指数较单独疫苗组、疫苗pPG-2/L.casei393联合免疫组差异极显著（p＜0.01）。表明疫苗与pGM-CSF联合免疫组诱导机体产生了更高的特异性免疫应答水平。在免疫后14d，进行攻毒保护试验，观察不同组小鼠发病和死亡情况，结果可知，单独疫苗组、疫苗与pPG-2/L.casei393联合免疫组攻毒保护率达33%，疫苗与pGM-CSF联合免疫组攻毒保护率可达50%。以上结果证明猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子具有较好的免疫佐剂效应，有效地增强了特异性免疫应答的水平，并在一定程度上提高了对病毒感染的保护效力。综上所述，本研究所获得的结果表明，通过干酪乳杆菌分泌表达了pGM-CSF蛋白，经检测具有良好的生物活性，与疫苗联合使用时具有良好的佐剂特性，为pGM-CSF的应用提供了实验数据和理论依据，并为其他疫苗佐剂的研究奠定了基础。