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宫颈癌是女性第三大常见肿瘤,严重威胁妇女健康。尽管官颈癌筛查在不断普及,但仍有大量未经筛查发现的中晚期病例。中晚期宫颈癌预后不良,5年生存率仅30-60%。泰素及铂类为主的化疗是中晚期宫颈癌不可或缺的治疗手段之一但化疗不敏感是导致治疗失败的最重要原因之一,迄今尚未找到有效的逆转方法。阐明宫颈癌细胞对化疗敏感性的机制对拓展宫颈癌根治性治疗手段,改善中晚期宫颈癌的预后意义重大。近年发现,上皮-间质转变(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)在肿瘤耐药中起重要作用,而微小RNA (MicroRNAs, miRNA)参与了EMT的调控,揭示miRNA对肿瘤细胞EMT的调控机制为破解肿瘤耐药的难题开辟了一个全新的途径。EMT指上皮细胞在一些因素的作用下,失去细胞极性,丢失细胞间紧密连接和黏附连接,获得了浸润、游走迁移能力,变成了具备间质细胞形态和特性的细胞,其表型表现为上皮细胞标志物E-钙粘着蛋白(E-cadherin Protein,E-cadherin)表达减少或缺失,间质性标志物波形蛋白(Vimentin Protein,Vimentin)、纤维结合蛋白(Fibronectin Protein, Fibronectin)、神经型钙黏附蛋白(N-cadherin Protein, N-cadherin)等表达升高。EMT是维系生命体组织平衡的基本生物事件,在个体发育和生长中起重要作用。研究证实,胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤的耐药细胞均发生EMT样转变；而具备间质细胞特征的肿瘤细胞可获得凋亡抵抗,进而对化疗耐药。已知有多种细胞因子和转录因子通过多种信号通路参与了EMT的调控,如Wnt、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、Notch信号通路等。近年来发现,miRNA也参与了肿瘤细胞的EMT。miRNA可通过直接靶向EMT表型分子E-cadherin或通过对EMT相关转录因子及信号通路分子的调控而影响EMT发生。但迄今为止,miRNA、EMT与肿瘤耐药的相关性研究尚处于起步阶段,尚未见miRNA、EMT与宫颈癌耐药的相关报道。本课题先利用miRNA芯片筛查差异表达的与宫颈癌泰素化疗相关的miRNA,进而从miRNA及其靶分子、信号通路和EMT的交汇点切入,在分子、细胞和组织标本多个水平,从细胞形态、表型和功能,及基因调控、信号通路等多个角度,求证miRNA在介导宫颈癌细胞EMT和化疗耐药中的作用。旨在揭示宫颈癌化疗耐药的本质并发现新的有效药物靶点,为改进中晚期宫颈癌的现行治疗模式提供科学证据。第一部分宫颈癌泰素耐药相关miRNAs的筛选和鉴定目的：筛选和鉴定宫颈癌泰素(Taxol)化疗相关miRNAs.方法：利用LC Sciences公司的μParaflo微流体芯片,分别比较5例泰素化疗敏感与4例泰素化疗耐药的宫颈鳞癌患者化疗前癌组织间miRNA表达谱的差异、4例宫颈鳞癌患者自身泰素化疗前后配对的癌组织间miRNA表达谱之间的差异,以差异倍数不低于2倍、芯片的信号值>500且P值<0.05的差异miRNAs作为阳性。对差异表达的miRNAs,从中选取表达上调的miR-375和miR-424及表达下调的miR-181b、miR-224和miR-27a,使用Stem-loop RT-PCR和Realtime PCR法检测泰素化疗前后宫颈细胞株及组织间上述miRNAs表达水平的变化。结果：1.宫颈鳞癌泰素化疗敏感、耐药组织间miRNA表达谱差异分析未发现差异表达的miRNA。2.宫颈鳞癌患者自身化疗前后配对的宫颈癌组织miRNA表达谱差异分析发现有13个miRNAs在化疗后的宫颈癌组织中表达下调、而8个miRNAs在化疗后的宫颈癌组织中表达上调。3. Stem-loop RT-PCR和Realtime PCR法证实miR-375和miR-424在经Taxol化疗后的细胞组明显上调(P<0.05),miR-181b、miR-27a和miR-224在经Taxol化疗后的细胞中的表达均显著下调(P<0.05)。4.MiR-375在Taxol化疗后的宫颈癌细胞和组织中,表达上调且呈剂量依赖性(P<0.05)。结论：1.经Taxol化疗后,宫颈癌细胞和组织可发生miRNA表达谱的改变。2Taxol化疗可以上调宫颈癌细胞及组织中miR-375的表达,提示miR-375可能参与调控宫颈癌细胞对Taxol敏感性。第二部分MiR-375参与调控宫颈癌细胞对泰素敏感性的研究目的：明确miR-375在调节宫颈癌泰素(Taxol)化疗敏感性中的作用。方法：通过慢病毒基因工程将Pre-miR-375及其相应阴性对照的慢病毒颗粒转染宫颈癌SiHa、Caski和HeLa细胞,应用流式细胞仪对阳性细胞(表达EGFP)进行筛选,得到稳定高表达miR-375及其相应阴性对照的宫颈癌细胞；用MTS法检测miR-375对Taxol的药物敏感性(给药的浓度梯度分别为0、5、10、20、50、100nM)的影响,以未转染的及转染了阴性对照序列的宫颈癌细胞作为对照,明确不同miR-375表达水平与宫颈癌Taxol化疗敏感性的相关性。结果：1.通过慢病毒基因工程构建并筛选得到高表达miR-375的宫颈癌SiHa、Caski和HeLa细胞,运用stem-loop realtime RT-PCR检测发现与转染control慢病毒对比,转染Pre-miR-375的宫颈癌细胞的miR-375水平显著升高(P<0.00)。2.MiR-375稳定高表达的宫颈癌SiHa、Caski和HeLa细胞的IC50分别为45.81士1.33nM、20.56士1.72nM和20.18士0.72nM；而对照组的IC50分别为8.54士1.52nM、7.98士2.60nM和13.28士0.52nM；随着miR-375的表达量升高,宫颈癌细胞对Taxol的化疗敏感性下降(P<0.05)。结论：1.采用慢病毒基因转染的方法可建立稳定表达miR-375的宫颈癌细胞模型。2.外源性上调miR-375后能降低宫颈癌细胞对Taxol化疗的敏感性。第三部分MiR-375通过靶向E-cadherin表达参与EMT及宫颈癌细胞对泰素的敏感性目的：探讨miR-375参与调节宫颈癌细胞对泰素(Taxol)化疗敏感性的分子机制。方法：首先通过Real-time RT-PCR及Western-blot法检测宫颈癌SiHa、Caski和HeLa细胞经不同浓度Taxol化疗前后E-cadherin及EMT相关分子的表达情况,并分析Taxol化疗与EMT及miR-375表达水平的相关性；其次分别利用TGF-β、EGF-β诱导宫颈癌细胞EMT、MTS检测细胞对药物的敏感性,以探讨EMT与宫颈癌细胞对Taxol耐药、EMT与miR-375表达间的调控关系；最后在生物学预测的基础上,通过荧光素酶报告基因、miR-375及E-cadherin的功能实验,揭示miR-375参与诱导的EMT及Taxol化疗耐药的分子机制。结果：1.宫颈癌SiHa、Caski和HeLa细胞经不同浓度Taxol化疗后72小时E-cadherin、 Vimentin在mRNA水平的表达与化疗前相比无明显差异(P>0.05)。2.宫颈癌SiHa、Caski和HeLa细胞经不同浓度Taxol化疗后72小时E-cadherin、 Vimentin、Fibronectin和N-cadherin的蛋白水平表达与化疗前相比有明显差异且呈Taxol剂量依赖性(P<0.05)。3.Taxol化疗前后E-cadherin蛋白水平表达与miR-375的表达水平呈负相关[rs=-0.345(Siha), rs=-0.476(Caski), P<0.05]。4Taxol可以诱导宫颈癌SiHa、Caski和HeLa细胞发生EMT；宫颈癌细胞EMT后对Taxol的敏感性明显下降,而对miR-375的表达无明显影响。5. E-cadherin是miR375的直接靶体；miR-375可以通过靶向抑制E-cadherin参与Taxol诱导EMT,引起官颈癌细胞对Taxol耐药。结论：1Ecadherin是宫颈癌细胞发生EMT的关键分子。2.EMT参与宫颈癌细胞对Taxol化疗的敏感性。3.MiR-375通过靶向抑制E-cadherin诱导EMT,引起宫颈癌细胞对Taxol耐药。