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背景与目的原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma)是指来源于肝脏的恶性肿瘤,而肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,)占原发性肝癌90%以上,其发病率占全球肿瘤发病率的第六位,死亡率占全球肿瘤相关死因的第三位。手术切除是早期原发性肝癌的首选治疗方法,但由于其发病隐匿,早期无明显症状,到就诊时已处于中晚期,因此目前的手术效果不理想,术后5年生存率只有约50%。研究证实机体免疫功能状态对原发性肝癌的疗效及预后有重大意义,免疫(immunity)是人体基本的一种生理功能,机体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分,从而能有效处理进入人体内的抗原物质或人体本身所产生的损伤细胞及肿瘤细胞,发挥免疫防御和免疫监视功能。执行免疫功能的组织、器官和细胞构成免疫系统。免疫细胞是免疫系统的重要组成,主要包括：中性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞等细胞。免疫细胞对抗原性物质所产生的反应称为免疫应答。免疫学发展初期人们认为免疫是机体对外源性抗原的特异反应,任何内外环境的物理和化学因素的刺激都可启动机体的应答,使机体做出“趋利避害”的反应。随着免疫学的发展,20世纪中期人们发现免疫系统可以识别体内肿瘤并对其产生应答,并通过动物实验证明了肿瘤抗原的存在以及其所诱导的免疫应答具有抗肿瘤作用。机体的免疫功能状态与恶性肿瘤的发生、发展密切相关,正常情况下机体可通过免疫监控将体内出现的变异细胞及发生癌变的细胞予以清除,从而可防止肿瘤发生,而当机体免疫功能低下时,变异及恶变的细胞可以凭借多种方式逃避免疫系统的监控而呈无限制生长而导致肿瘤发生。在机体抵抗肿瘤的免疫中,细胞免疫尤其是T细胞免疫发挥着关键作用。目前有研究证实,肝癌的发生、发展、预后与机体的免疫状态密切相关,肝癌细胞坏死可诱导特异的T细胞免疫反应,肿瘤发生后机体主要通过T细胞亚群对肿瘤细胞进行免疫伤害,同时影响着肿瘤总体积及肿瘤分期。HBV-DNA (Hepatitis B virus-DNA)定量主要是用来判断人体内感染乙肝病毒水平,在一定程度上能反映出HBV的复制活跃程度,HBV持续感染是HBV相关性肝癌发生、发展的重要因素,与机体免疫也密切相关,随着对肝癌患者免疫功能的深入研究及免疫学的不断发展,目前针对肝癌的生物免疫治疗己成为肝癌辅助治疗新的研究热点。本研究通过流式细胞术测定肝细胞肝癌患者术前外周血T淋巴细胞亚群改变,旨在探讨原发性肝细胞肝癌术前T细胞免疫功能状况、NK细胞、中性粒细胞及淋巴细胞比值(neutrophil to lymphocyte ratio, NLR)的相关影响因素。方法1、一般资料 收集广州南方医院肝胆外科2014年10月-2015年11月经术后病理证实为原发性肝细胞性肝癌患者45例作为实验组,入选标准：①HBsAg阳性患者；②肝功能Child-Pugh分级为A级或B级；③术前未行射频介入、消融、化学药物治疗和放射治疗；④术前均排除感染、血液系统疾病等疾病；⑤手术为根治性原发性肝细胞肝癌切除术,术后病理切缘阴性。其中男性患者30例,女性患者15例,年龄37岁-63岁,中位年龄50岁；对照组为同时间段南方医院健康体检中心正常成年人,其中男性29例,女性16例,年龄27-57岁,中位年龄为42岁。收集包括年龄、性别、术前血清甲胎蛋白(AFP)水平、HBV-DNA定量、HBeAg、术前1周内外周血T淋巴细胞亚群、血常规、肝功能、凝血功能等检验结果,影像学资料包括肿瘤大小、位置、个数、腹水、肝硬化等情况。术后病理资料包括病理类型、肿瘤最大直径、血管侵犯程度、标本切缘情况和肝功能Child-Pugh分级情况等临床资料。2、样本采集和处理 所有对照组病例于术前一周内、对照组均于体检当日抽取抽取清晨空腹外周静脉血10 mL进行分析。肝素抗凝管收集,收集后6 h内进行处理。各取100u1外周血,分别加入"CD4-FITC、CD8-PE、CD3-PerCP",或者"CD8-FITC、CD28-PE", "CD25-PE、CD4-FITC"或者‘’CD3-FITC"、 CD16-PE、D56-PE"标记,行流式细胞术检测CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD8+CD28-T细胞、CD8+CD28+T细胞、CD4+CD25+T细胞和NK细胞在淋巴细胞中频数以及CD4+/CD8+T细胞比值,根据公式计算患者的中性粒细胞及淋巴细胞比值(neutrophil to lymphocyte ratio, NLR)及肿瘤总体积(total tumor volume, TTV)。肿瘤体积的计算方法可参考球体积公式：肿瘤体积(cm3)=4/3×3.14×r3(r=可测量肿瘤结节的最大半径)。TTV等于各可测量病灶体积总和。肿瘤半径由术前影像学检查结果可得出。NLR根据患者术前1周内外周血常规检验结果的中性粒细胞值及淋巴细胞值比值得出。3、统计学方法 采用SPSS19.0软件对数据进行统计分析。连续变量以均数±标准差形式表示,两组之间比较采用两独立样本t检验。双侧检验P值小于0.05认为有统计学意义,相关分析采用Pearson相关分析。结果3.1肝癌组和对照组之间免疫细胞水平的差异：原发性肝细胞癌患者CD3+T细胞、CD4+T细胞频数及CD4+/CD8+T细胞比值明显低于对照组,两组之间差异具有统计学意义,其P值分别为0.015、<0.001和<0.001,而原发性肝细胞肝癌组CD8+T细胞值明显高于正常组,两组之间差异具有统计学意义(P=0.035),提示肝癌患者体内T细胞亚群组份发生变化。进一步分析,CD8+CD28-T和CD4+CD25+T细胞频数在肝癌组中高于对照组,其差异具有统计学意义,P值分别为0.008、0.041,而CD8+CD28+T细胞频数在两组之间没有统计学差异(P=0.166),提示肝癌患者外周血中抑制性T细胞频数增多。3.2肝癌患者中各不同巴塞罗那分期(BCLC)之间免疫细胞的差异：本课题患者BCLC0期10例、A期16例、B期19例,CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+CD28+T细胞频数分别在各个分期之间没有显著差异(Kruskal-Wallis Htest,P>0.05).CD8+T细胞频数在3个分期之间有统计学差异(Mann-Whitney U test, P=0.042),随着级别的升高,CD8+T细胞频数有升高的趋势,在B期中高于0期(P=0.035)。CD4+/CD8+T细胞比值在3个分期之间有统计学差异(P=0.043),随着级别的升高,CD4+/CD8+T比值有降低的趋势,在B期中低于0期(P=0.032)。CD8+CD28-T细胞频数和CD4+CD25+T细胞分别在3个分期之间有统计学差异(P=0.045和P=0.041),随着巴塞罗那分期级别的升高,两者均有升高的趋势,在B期中均高于0期。NK细胞频数和NLR在各分期之间没有统计学差异(P>0.05)。3.3原发性肝细胞癌患者中免疫细胞与HBV-DNA的关系：CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+T细胞比值、CD8+CD28-T细胞、CD8+CD28+T细胞、CD4+CD25+T细胞频数、NLR和NK细胞频数分别在HBV-DNA<l×103 copies/mL和HBV-DNA>1×103 copies/mL两组之间没有统计学差异(P>0.05)3.4原发性肝细胞癌患者各免疫细胞与HBeAg的关系：CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+T细胞比值、CD8+CD28-T细胞、CD8+CD28+T细胞、CD4+CD25+T细胞频数、NLR和NK细胞频数分别在HBeAg+和HBeAg-之间没有统计学差异(P>0.05)3.5.原发性肝细胞癌患者各免疫细胞与肿瘤大小的关系：一方面,将单发肝癌直径<5cm的患者分为为小肝癌组,将多发肝癌或单发肝癌直径>5cm的患者为大肝癌组,结果显示：CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD25+T细胞频数和NK细胞在大小肝癌组之间没有统计学差异(P>0.05), CD4+/CD8+T细胞比值在大肝癌组中比小肝癌组明显降低(P=0.002),CD8+CD28-T细胞在大肝癌组中比小肝癌组明显升高(P=0.009), NLR在大肝癌组中则高于小肝癌组。另一方面,将各T细胞亚群频数、CD4+/CD8+T细胞比值与TTV关系相关性分析,结果显示CD4+/CD8+T细胞比值与TTV呈正相关(P=0.001),与CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CCD8+CD28-T细胞、CD8+CD28+T细胞和CD4+CD25+T细胞频数无明显相关(P>0.05)结论：原发性肝癌患者体内T细胞亚群与正常人不一样,外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞明显低于正常人,而CD8+T细胞、CD8+CD28-T细胞和CD4+CD25+T细胞亚群水平则明显高于正常人；肝癌中,肿瘤的进展可能与CD8+CD28-T细胞和CD4+CD25+T细胞亚群水平升高有关。该两群调节性T细胞亚群可能参与肝癌的发生、发展,有可能与肝癌的疗效相关。