论文部分内容阅读
结核病是由结核杆菌感染所引起的一种慢性传染病，严重威胁人类健康。特别是由于近年来抗生素类药物的滥用导致了大量耐药菌的出现，更加剧了结核病对人类健康的危害，新型抗结核药物以及疫苗的开发已是迫在眉睫。 β内酰胺类抗生素（β-lactams）早已被广泛用于治疗各种细菌感染，其作用机理是通过抑制细菌D，D-转肽酶的肽聚糖交联活性，从而干扰细胞壁的合成。然而到目前为止，该类抗生素中还没有一种有效的抗结核药物。研究发现其中一个重要的原因是结核杆菌自身编码一种A类β内酰胺酶BlaC，它可以水解各种β内酰胺类抗生素，唯一例外的是碳青霉烯类抗生素(如meropenem，imipenem)。 2009年，Blanchard小组解析了BlaC和meropenem复合物的结构，并且证明联合使用meropenem与BlaC的抑制剂clavulanate可以有效对抗13株泛耐药结核杆菌(XDR-TB)。研究发现，结核杆菌在转向休眠期时，其细胞壁肽聚糖交联形式发生重建，主要由4-3交联转变为3-3交联。Lamichhane小组发现LdtMt2蛋白在3-3交联形成过程中起关键作用，缺失LdtMt2会导致慢性感染期的结核杆菌菌落形态发生改变、失去毒性且对amoxicillin-clavulanate的敏感性增加。LdtMt2是结核杆菌最主要的L，D-转肽酶，催化肽聚糖3-3交联的形成。这类转肽酶对一般的β内酰胺类抗生素不敏感，但是碳青霉烯类抗生素(包括meropenem)却可以有效抑制其活性。为了阐明meropenem抑制LdtMt2的作用的分子机理，我们解析了LdtMt2及其与meropenem复合物的晶体结构。 我们报道了LdtMt2的N端截短体N55(LdtMt2，55-408)、Trypsin消化产物N140(LdtMt2，140-408)及其与meropenem复合物的结构，分辨率分别为2.5(A)、1.8(A)、和1.4(A)。通过结构分析揭示meropenem抑制LdtMt2可能的分子机制。 △N55的结构是由N端的两个Ig-like结构域(氨基酸残基60-148和149-250)和C端的YkuD结构域（氨基酸残基251-408）线性排列组成的。两个Ig-like结构域对Yku催化结构域起空间臂的作用。YkuD结构域包含Cys354-His336-Ser337催化三联体，其中Cys354是其直接的酶活反应中心以及carbapenem的靶点。LdtMt2还包含两个额外的结构域A（氨基酸残基300-323）和B（氨基酸残基379-408），结构域A与△140-meropenem复合物的稳定性相关。 △140-meropenem复合物晶体结构中一个不对称单位内含有两个△140-meropenem复合物分子。Meropenem在两个复合物分子中采取不同的构象，我们将其命名为状态一和状态二。在两个状态中，meropenem都通过硫酯键与催化残基Cys354共价连接。△N140-meropenem复合物的结构显示:meropenem分子中C2与C3之间的双键被C3与N4之间的双键所替换，据报道这种伴随着碳青霉烯类抗生素核心与L，D转肽酶共价连接而发生的互变异构现象，会引起BlaC对meropenem水解过程中的慢转化，因而我们推测，互变异构帮助稳定了△N140-meropenem复合物的结构。 在状态二中，meropenem的核心围绕C5和C6之间的单键翻转了大约180°，并且由于翻转，引起Tyr308围绕Cα/Cβ之间的单键旋转了大约90°。Tyr308侧链的旋转与meropenem核心的翻转，使得在状态二中出现了三对额外的氢键(Tyr318OH-MerOH62，Tyr318OH-MerO32，and Tyr308OHMerO32)，而在状态一中，只观察到一对氢键(Gly353N-MerO7)。Y318F与Y318A两个突变体蛋白也显示出比野生型蛋白对meropenem更快的水解速率，暗示额外生成的氢键对于酶-药物复合物的稳定性有重要的作用，同时也揭示了由meropenem的翻转而导致的额外氢键的生成与meropenem抑制LdtMt2活性的机制有关。 结合已经报道的BlaC-meropenem复合物的结构，我们分析了meropenem-LdtMt2复合物稳定性的结构基础，对于β内酰胺类抗XDR-TB新药的研发提供了新的研究策略。