研究背景:新生儿缺血缺氧性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）是指各种围生期窒息引起的部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停而导致的胎儿或新生儿脑损伤。脑组织以水肿、坏死和凋亡为主要病变,轻者预后良好,重者引起新生儿死亡或遗留神经系统后遗症。HIE发病机制复杂,涉及多个层次,单纯的对症支持治疗不能从根本上改善患儿的脑损伤及远期预后,而目前的神经保护疗法也都处于探索阶段,故寻找治疗HIE更为有效的方法仍是国内外研究的重要课题。HIE从损伤开始一直延续到复苏后的再灌注期间,其发病机制包括循环因素（脑血流量失调）、生化代谢因素（ATP减少、无氧代谢增加、兴奋性氨基酸增加、细胞内钙离子聚集、氧自由基及炎症因子的产生）,这些发病机制是研发脑损伤后神经保护疗法的基础。近年来,国内外研究发现环磷腺苷（Cyclic Adenosine-3’5’-monophosphata,cAMP）参与了多种神经系统疾病的发病机制,在神经系统损伤的修复中也占有重要的地位。cAMP是核苷酸衍生物,是细胞内传递激素和递质的中介因子,因此也被称为“第二信使”。细胞内cAMP由ATP经腺苷酸环化酶（AC）催化而成,由磷酸二酯酶（PDE）降解,cAMP维持稳定是由二者的功能状态决定的。细胞内cAMP浓度的改变影响多种细胞内信号转导途径,从而调控蛋白活性、基因表达及细胞功能,对细胞的分化、生长、代谢及调亡过程发生影响。研究表明cAMP在神经系统损伤中起重要的调控作用:①影响神经细胞膜蛋白的结构和功能;参与中枢神经系统突触传递:②调节脑血管的舒缩功能;③阻止钙离子内流;④抑制病理状态下细胞内各种损害性细胞因子的表达和产生,如肿瘤坏死因子、白细胞介素、淀粉样物质等;⑤抗凋亡及促进神经功能的恢复;⑥参与学习、记忆的过程。动物实验表明缺血再灌注损伤后大脑皮层及海马组织cAMP和AC mRNA水平下降;脊髓损伤后受损局部及相应大脑皮层cAMP水平也下降。临床研究发现新生儿窒息后脑脊液中cAMP含量下降,且脑脊液中cAMP的水平与病情的严重程度及预后密切相关。cAMP可能是调节中枢神经系统功能的关键性因子之一,cAMP水平下降必将引起神经系统某些功能紊乱,从而导致疾病的发生。由此可以设想,缺血缺氧损伤后及时补充外源性cAMP,或给予延缓cAMP降解的药物,提高cAMP水平至安全边界,可能会在早期阻止cAMP信号途径失调导致的瀑布效应,最大限度地减轻缺血缺氧造成的损伤,促进损伤神经元功能的恢复。研究表明脊髓损伤后给予外源性db-cAMP和PDEⅣ抑制剂rolipram,提高细胞内cAMP水平后,可促进轴突再生、髓鞘的形成及神经功能的恢复;另外还有研究表明脑缺血后给予rolipram可增强缺血后海马神经元的再生,促进新生神经元的存活。环磷腺苷葡胺（MCA）是cAMP的新型衍生物,其以葡甲胺为配基增加了cAMP的脂溶性,使其更容易进入细胞内发挥作用,同时葡甲胺对磷酸二酯酶也具有抑制作用,更有利于cAMP生理功能的发挥。MCA在临床上已广泛用于治疗心功能不全,对新生儿窒息后心肌损伤也有一定的治疗作用。有人观察到MCA对成年大鼠脑缺血再灌注损伤的影响,结果显示MCA预处理可减少梗死时神经细胞的损伤,改善预后。但MCA对新生儿或新生动物缺血缺氧后脑损伤是否具有保护作用国内外尚未见报道。氨茶碱是茶碱和乙二胺的复盐,为非选择性PDE抑制剂,通过抑制PDE,延缓细胞内cAMP的降解,提高细胞内cAMP水平。氨茶碱广泛应用于临床,其药理作用是多方面的:主要包括扩张支气管、强心、利尿、抗炎、治疗早产儿反复呼吸暂停、调节脑血流动力学等方面。研究表明茶碱及氨茶碱可改善中风后神经损伤;减轻缺血后脑水肿及脑损伤;也有研究显示茶碱对新生鼠缺血缺氧后脑损伤具有保护作用。从理论上来讲,MCA与氨茶碱联合应用在提高细胞内cAMP水平,调节脑血管舒缩功能,抗炎作用,改善心功能等方面可能具有协同作用。目的:本研究采用新生大鼠缺血缺氧性脑损伤（HIBD）模型,试图了解HIBD后脑组织内cAMP水平的变化及其与脑损伤的关系,初步探讨外源性给予cAMP类药物（MCA）、氨茶碱及两药联合应用对新生鼠HIBD的神经保护作用,旨在为新生儿HIE的临床治疗提供新的思路与药物。方法:1.新生鼠HIBD模型制作及模型成功的标准参照Rice法制作新生鼠HIBD模型,新生SD大鼠经无水乙醚麻醉后常规消毒,颈部正中切口,游离左侧颈总动脉,4号丝线永久结扎做缺血处理,缝合皮肤,生理盐水擦干表面的血渍。术后恢复1-2h后,将动物置于37℃常压缺氧舱内,以2-3L/min的速度通入92%N₂-8%O₂混合气体,2h后取出,制成HIBD模型,缺氧后返回母鼠身边继续喂养。缺血缺氧后参照Zeal Longa5分法进行评分。0分:无神经功能缺损的症状;1分:轻度局灶性神经功能缺损,即提尾悬空不能伸展左侧前爪;2分:中度局灶性神经功能缺损,即行走向左侧转圈;3分:重度局灶性神经功能缺损,即行走困难,向左侧倾倒;4分:不能自发行走,意识水平下降。评分1-4分为造模成功。假手术组只切开颈部皮肤,游离左侧颈总动脉,不结扎,缝合皮肤后不入缺氧舱,常规喂养。未出神经功能缺损症状或死亡的动物被剔除,随机补充剔除的标本,保证每组的实验例数为6例。2.实验分组2.1.缺血缺氧后脑组织内cAMP含量的变化36只7日龄SD大鼠,随机分为假手术组、缺血缺氧后2h组、24h组、48h组、72h组、168h（7天）组,每组6只;各组均厂缺血缺氧后腹腔注射生理盐水4ml/Kg,2次/日。2.2.MCA和氨茶碱对新生大鼠HIBD的干预作用180只7日龄SD大鼠,随机分为假手术组、HIBD组、MCA组、氨茶碱组、MCA+氨茶碱组（合用组）;每组36只;造模成功后,MCA组、氨茶碱组及合用组以腹腔注射法分别予MCA2mg/Kg、氨茶碱2mg/Kg、MCA2mg/Kg+氨茶碱2mg/Kg,2次/日,连用3天:HIBD组只注射等量的生理盐水。3.主要观察指标3.1.缺血缺氧后脑组织内cAMP水平的变化各组分别在缺血缺氧后0h（假手术组）、2h、24h、48h、72h、168h断头取左脑,制成10%的脑组织匀浆,用双抗体夹心ABC-ELISA法测定各组脑组织内cAMP含量。3.2.药物干预后脑组织内cAMP水平的变化:各组分别予缺血缺氧后24h、48h、72h断头取左脑,制成10%的脑组织匀浆,用双抗体夹心ABC-ELISA法测定各组脑组织内cAMP含量。3.3.药物对缺血缺氧后脑组织含水量及脑损伤程度的影响缺血缺氧后72h,断头取脑,电子天平分别称出左右侧大脑湿重,然后将大脑置于80℃恒温干燥箱中48h后取出,称干重。根据以下公式计算脑组织含水量及脑损伤程度:脑组织含水量=（损伤侧湿重-损伤侧千重）/损伤侧湿重×100%;脑损伤=（未损伤侧湿重-损伤侧湿重）/未损伤侧湿重×100%（缺血缺氧损伤后由于脑组织大面积的坏死,液化和萎缩,使损伤侧大脑的重量明显轻于未损伤侧,以此反应脑损伤的程度）。3.4.药物对缺血缺氧后脑组织氧化代谢产物丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）含量的影响:缺血缺氧后72h,断头取左脑,制成10%的脑组织匀浆,SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定;MDA应用改良的硫代巴比妥酸法测定。3.5.药物对缺血缺氧后脑组织病理改变的影响新生鼠深度麻醉,行心脏灌注后,断头取全脑,以4%多聚甲醛液固定24h,取材后行脱水,石蜡包埋,冠状切片,苏木素-伊红（HE）染色,分别在200倍、400倍镜下观察大脑皮质结构及细胞形态变化。3.6.药物对缺血缺氧后神经功能缺失评分的影响各组新生鼠于缺血缺氧后2h,24h,72h参照Zeal Longa 5分法行运动功能评分。统计:所有数据经SPSS13.0统计软件进行统计学处理,数据用均数±标准差表示,药物干预后脑组织内cAMP含量的比较、神经功能缺失评分的比较采用重复测量因素的方差分析。缺血缺氧后脑组织内cAMP水平的变化、脑组织含水量的比较、MDA、SOD含量的比较均采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD检验;方差不齐采用WelCh矫正分析,组间多重比较采用DunnettT3法检验;P＜0.05表示差异有统计学意义。结果:1.缺血缺氧后脑组织内cAMP水平的变化经组间多重比较显示:假手术组脑组织内cAMP含量最高;与假手术组相比,缺血缺氧后2h组、24h组、48h组、72h组、168h组cAMP含量均显著下降,差异有统计学意义（P=0.000）;与2h组相比,24h组、48h组、72h组、168h组cAMP含量有逐渐升高的趋势,差异有统计学差异（P=0.000）.2.药物干预后脑组织内cAMP水平的变化:24h,假手术组、HIBD组、氨茶碱组、MCA组、合用组脑组织内cAMP含量有显著差异（F=960.203,P=0.000）;与HIBD组相比,药物干预组（氨茶碱组、MCA组、合用组）cAMP含量显著升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;合用组cAMP含量高于氨茶碱组、MCA组（P＜0.05）;氨茶碱组与MCA组无显著差异（P=0.748）。48h,各组脑组织内cAMP含量有显著差异（F=363.233,P=0.000）,MCA组和合用组cAMP含量高于HIBD组（P＜0.05）,氨茶碱组与HIBD组无显著差异（P=0.418）,合用组cAMP含量高于氨茶碱组、MCA组（P＜0.05）;氨茶碱组cAMP的含量低于MCA组（P=0.042）。72h,各组脑组织内cAMP含量有显著差异（F=122.398,P=0.000）,与HIBD组相比,氨茶碱组cAMP含量无显著差异（P=0.082）,MCA组、合用组cAMP含量显著升高,差异有统计学意义（P=0.000）,合用组cAMP含量高于氨茶碱组、MCA组（P=0.000）;氨茶碱组cAMP含量低于MCA组（P=0.027）。3.药物对缺血缺氧后脑组织含水量及脑损伤程度的影响:脑组织含水量比较:氨茶碱组脑组织含水量最少;与假手术组相比,氨茶碱组、合用组含水量无显著差异（P=0.994、P=0.097）,HIBD组、MCA组含水量显著升高（P＜0.05）;与HIBD组相比,药物干预组含水量均显著下降,差异有统计学意义（P＜0.05）;与合用组相比,MCA组含水量升高（P=0.013）,氨茶碱组含水量下降（P=0.036）;MCA组含水量高于氨茶碱组（P=0.002）。脑损伤程度比较:假手术组脑损伤程度最轻:与假手术组相比,HIBD组、MCA组、氨茶碱组、合用组均有不同程度脑损伤,以合用组脑损伤程度最轻,差异有统计学意义（P=0.0000）;与HIBD组相比,药物干预组脑损伤程度均有不同程度的减轻,差异有统计学意义（P≤0.002）;氨茶碱组与MCA组差异无统计学意义（P=0.538）。4.药物对缺血缺氧后脑组织MDA、SOD含量的影响MDA含量的比较:HIBD组脑组织内MDA含量最高:与假手术组相比,合用组MDA含量无显著差异（P=0.385）,HIBD组、MCA组、氨茶碱组MDA含量均显著升高（P=0.000）:与HIBD组相比,药物干预组MDA含量均下降（P=0.000）;合用组MDA含量低于氨茶碱组及MCA组,差异有统计学意义（P=0.000）;氨茶碱组与MCA组无显著差异（P=1.000）。SOD含量的比较:HIBD组脑组织内SOD含量最低;与假手术组相比,合用组SOD水平无显著差异（P=0.326）,HIBD组、MCA组、氨茶碱组SOD水平显著降低（P=0.000）;与HIBD组相比,药物干预组SOD水平均显著升高,差异有统计学意义（P=0.000）;合用组SOD水平高于氨茶碱组及MCA组（P=0.000）;氨茶碱组与MCA组无显著差异（P=0.383）。5.药物对缺血缺氧后脑组织病理改变的影响假手术组及非损伤侧大脑:神经细胞数目多,皮层分层清晰,可清晰的分辨出6层细胞层。细胞形态结构清楚,排列整齐,核深染,核仁清晰。HIBD组:左侧大脑可见皮层结构紊乱,组织结构疏松,有许多散在的空洞（坏死液化区）,神经元细胞核固缩,胞体缩小变形,神经元细胞正常形态消失.氨茶碱组:与非损伤侧相比,损伤侧神经细胞数目减少,皮层结构较清晰,细胞形态不清,排列不齐,可见多个神经元细胞核固缩,核仁不清或消失,细胞缩小变形。MCA组:神经细胞数目较多,皮层结构较清晰,细胞形态结构较清楚,排列较整齐,但仍有少数神经元细胞核固缩,细胞缩小变形.合用组:神经细胞数目较氨茶碱组、MCA组多,皮层结构清晰,神经元细胞形态规整,核仁清晰,胞浆丰富,但仍可见个别细胞缩小变形.6.药物对缺血缺氧后神经功能缺失评分的影响假手术组在2h,24h,72h神经功能缺失评分均为0分,2h各组间评分无显著差异（F=0.524,P=0.475）;24h各组间评分有显著差异（F=14.832,P=0.001）,氨茶碱组、MCA组和合用组的评分低于HIBD组,氨茶碱组与MCA组、合用组评分无显著差异;72h各组评分有显著差异（F=24.653,P=0.000）,氨茶碱组、MCA组和合用组的评分低于HIBD组,合用组的评分低于氨茶碱组、MCA组;氨茶碱组与MCA组无显著差异（P=0.718）。结论:1.实验证实缺血缺氧后脑组织内cAMP代谢紊乱,缺氧后2小时脑组织内cAMP水平明显下降（至正常的25%左右）,随着时间的延长可逐渐升高,但7天后仍低于正常水平（达70%左右）,说明缺血缺氧后机体有一定的自我修复能力,但能力有限且修复时间较长,这为cAMP类药物的临床应用提供了实验依据。2.研究显示MCA干预后可显著提高细胞内cAMP水平、减轻脑水肿,减少氧自由基的生成,有效改善临床运动功能;提示cAMP代谢紊乱可能参与脑缺血缺氧损伤的病理机制,及早给予外源性cAMP类药物对缺血缺氧性脑损伤具有一定的保护和修复作用。3.研究发现氨茶碱可协助cAMP类药物提高细胞内cAMP水平;氨茶碱单独应用同样具有减轻脑组织损伤作用,提示氨茶碱可能通过多重药理作用发挥了脑保护作用。4.两药联合应用,除脑含水量指标外,其它指标均优于单用药组,提示MCA与氨茶碱联合应用在缺血缺氧性脑损伤的治疗中可能具有良好的协同作用。