【摘 要】
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青蒿素是从黄花蒿中提取的一种倍半萜内酯化合物。AaCYP71AV1和Aa AL DH1是青蒿素合成的关键酶基因。本研究克隆了黄花蒿AaCYP71AV1和AaALD H1启动子及基因序列,构建组成型植物表达载体35S::AaCYP71AV1、35S::Aa A LDH1及AaCYP71AV1和AaALDH1基因启动子的GUS报告载体。以实验室前期获得的转生长素合成关键酶基因iaa M的黄花蒿叶盘为受
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青蒿素是从黄花蒿中提取的一种倍半萜内酯化合物。AaCYP71AV1和Aa AL DH1是青蒿素合成的关键酶基因。本研究克隆了黄花蒿AaCYP71AV1和AaALD H1启动子及基因序列,构建组成型植物表达载体35S::AaCYP71AV1、35S::Aa A LDH1及AaCYP71AV1和AaALDH1基因启动子的GUS报告载体。以实验室前期获得的转生长素合成关键酶基因iaa M的黄花蒿叶盘为受体材料,开展二价遗传转化研究,旨在在一价转iaa M基因黄花蒿腺毛中促进生长素合成的基础上,使黄花蒿AaCYP71AV1和AaALDH1基因在青蒿素生物合成途径中过量表达。以期在提高腺毛细胞生长速率和活跃细胞代谢水平的同时,获得更多青蒿素合成的前体物质,有效提高青蒿素的含量。研究成功建立了内源青蒿素合成酶基因和外源生长素合成酶基因的二价转基因黄花蒿遗传转化体系,获得的二价转基因植株,其叶片腺毛大小、密度和青蒿素含量均有显著性提高。主要研究结果如下:1.根据NCBI报道的黄花蒿AaCYP71AV1和AaALDH1基因启动子和CDS序列信息,利用PCR、RT-PCR技术分别克隆获得AaCYP71AV1、AaALDH1基因的启动子序列和c DNA序列。经测序分析后将上述启动子与基因分别构建了AaCYP71AV1Pro::GUS、AaALDH1Pro::GUS报告载体和35S::AaCYP71AV1、35S::AaALDH1植物表达载体。2.以黄花蒿品种（428-A）为受体利用农杆菌介导的叶盘转化法将GUS报告载体（AaCYP71AV1Pro::GUS、AaALDH1Pro::GUS）转化黄花蒿,获得转基因植株。GUS组织化学染色结果显示,上述两种启动子驱动的GUS报告基因在黄花蒿叶片腺毛中均有较高的表达活性,证实了AaALDH1、AaCYP71AV1基因在黄花蒿腺毛细胞中的特异性表达,进一步说明腺毛细胞是青蒿素合成和储存的关键部位。3.以一价转基因GTpro::iaa M黄花蒿为受体,利用农杆菌介导的叶盘转化法将植物表达载体（35S::AaCYP71AV1、35S::AaALDH1）进行黄花蒿的二价遗传转化,对获得的二价转基因（GTpro::iaa M/35S::AaCYP71AV1、GTpro::iaa M/35S::AaALDH1）植株经PCR分子鉴定,表明AaCYP71AV1、AaALDH1基因成功转化到受体植株。4.利用RT-PCR半定量、qRT-PCR荧光定量分别检测AaALDH1、AaCYP71AV1基因在转基因黄花蒿中的表达情况,结果显示在二价转基因黄花蒿植株中,AaALDH1、AaCYP71AV1基因表达量对比对照植株和一价受体转基因植株均有显著提高,该结果提示,过表达青蒿素合成酶基因有望促进青蒿素的合成。而一价受体转基因植株中AaALDH1、AaCYP71AV1基因表达量与对照植株没有明显变化,说明在腺毛细胞中特异性表达生长素合成酶基因iaa M对青蒿素合成酶基因的表达量没有直接影响。5.通过荧光显微镜和扫描电镜对黄花蒿叶片腺毛的观察表明,一价受体转基因植株和两种二价转基因植株叶片分泌型腺毛密度和顶细胞大小比对照植株均明显增大,在统计学上具极显著差异。6.采用HPLC法检测转基因黄花蒿青蒿素的含量,结果表明,两种二价转基因黄花蒿植株青蒿素含量分别为27.77mg/g、28.19mg/g,比对照植株提高了2.3倍和2.4倍,一价受体转基因GTpro::iaa M植株青蒿素含量为15.52mg/g,相较于对照植株提高了1.3倍。综上所述,iaa M基因在黄花蒿腺毛中的特异表达,能有效提高腺毛发育过程中的生长素浓度,从而促进黄花蒿腺毛的发育,增加腺毛密度和大小,进而提高了青蒿素含量;在此基础上过表达AaALDH1、AaCYP71AV1基因,能促进青蒿素生物合成途径中青蒿素前体的有效合成和积累,最终提高青蒿素的含量。
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