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神经胶质瘤是人类最常见的脑部肿瘤,已成为15岁以下儿童肿瘤致死的第二大病因,是导致35~54岁成年男性和15~34岁女性肿瘤死亡的第四大病因。目前,恶性胶质瘤的常规治疗手段(手术加放化疗)治疗困难、远期效果差,死亡率高。对于恶性程度高的胶质瘤患者,生存期短、5年生存率小于1%。怎样改善胶质瘤的治疗效果,是临床面对的一个难题。近年来,随着分子生物学、分子遗传学的研究进展,对于肿瘤的基因治疗方面取得了长足进步,为提高恶性胶质瘤的治疗效果,增加患者的生存率开拓了新的思路。白细胞介素24(interleukin-24,IL-24)是细胞因子白介素10家族的新成员,由于最初在人类黑色素瘤中发现,因此也被称为黑色素瘤分化相关因子-7(melanoma differentiation-associated gene-7,mda-7)基因。研究发现,IL-24对多种肿瘤细胞(肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌等)均有选择性的抑制作用。此外,IL-24与化疗、放疗相结合的研究表明,将IL-24基因转染入人非小细胞肺癌的细胞后,可增强此肿瘤细胞对放射治疗的敏感性,而同时接受照射的人正常成纤维细胞则未受此放射线照射的影响。由于IL-24特有的杀伤肿瘤细胞,而对正常细胞没有损伤作用的生物学特点,现已成为基因治疗的候选基因,并成功用于1期临床研究。目前,关于IL-24对胶质瘤作用的研究报道尚少,尤其对于IL-24诱导胶质瘤细胞凋亡的分子机制尚缺乏足够的了解。本研究应用新型重组腺病毒载体(Ad5F35-IL24),将IL-24基因导入人胶质瘤U251细胞,应用MTT、流式细胞术、双荧光染色、Hoechst 33258荧光染色、Annexin V-FITC凋亡试剂盒和单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis; SCGE)等技术,体外观察Ad5F35-IL24对U251细胞的杀伤作用。同时用transwell细胞侵袭实验、细胞划痕实验(Cell scratch assay)检测药物作用后肿瘤细胞侵袭、迁移能力的改变。应用Western blot印迹检测外源性IL-24基因转染U251细胞后, ERK、p-ERK、p38 MAPK和p-p38 MAPK等细胞信号转导通路蛋白的表达水平变化。同时应用MTT、流式细胞术、双荧光染色观察ERK、p38 MAPK蛋白抑制剂PD98059、SB203580作用后,对IL-24基因介导U251细胞杀伤中作用的影响。应用Western blot印迹、RT-PCR、流式细胞术、免疫细胞化学的方法检测bcl-2、caspase-3和TopoⅡα蛋白的表达变化情况。以期更深入的了解IL-24基因可能的效应途径和作用靶点,为进一步提高临床神经胶质瘤治疗效果提供研究基础。第一部分Ad5F35-IL24重组腺病毒载体的构建目的:构建重组腺病毒载体Ad5F35-IL24。方法:先用HindⅢ和SalⅠ双酶切ATCC质粒,得到目的条带,然后再用HindⅢ和SalⅠ双酶切pDC316质粒,得到线性化的载体条带,进行片断连接,转化,筛选得到重组的pDC316-IL24质粒。随后用PCR和酶切的方法对重组pDC316-IL24质粒进行鉴定;最后经全自动核酸分析仪上进行序列测定证实连接正确。制备感受态细胞,进行转化,大量制备质粒DNA;之后用双质粒共转染293细胞,产生重组腺病毒Ad5F35-IL24。进行病毒扩增、纯化,计算病毒滴度,按照公式:病毒滴度(PFU/mL)=GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数/0.5 mL。结果:成功构建载有IL-24基因的重组pDC316-IL24质粒,并用PCR、酶切、序列测定和BLAST的方法进行了鉴定,证明连接正确;获得了携带IL-24基因的大肠杆菌菌株;成功构建成载有IL-24基因的增殖能力缺陷的新型重组腺病毒Ad5F35-IL24,并进行了扩增和纯化。测得病毒滴度为2.8×108 PFU/mL。结论:成功构建携带IL-24基因,具有增殖能力缺陷的新型重组腺病毒Ad5F35-IL24载体。第二部分腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞的侵袭、迁移及杀伤作用目的:观察IL-24基因对U251人胶质瘤细胞的杀伤作用,及其对肿瘤细胞侵袭、迁移能力的影响。方法:用MTT、流式细胞术、双荧光染色、Hoechst 33258荧光染色、Annexin V-FITC凋亡试剂盒和单细胞凝胶电泳( Single cell gel electrophoresis; SCGE)等技术,观察Ad5F35-IL24对U251细胞的杀伤作用。同时用transwell细胞侵袭实验和细胞划痕实验(Cell scratch assay),检测药物作用后对肿瘤细胞侵袭和迁移能力的影响。结果:与空白对照组和空载体组相比,Ad5F35-IL24能够抑制人U251细胞的增殖,诱导细胞凋亡,且随着Ad5F35-IL24药物浓度的增加,细胞杀伤率增加明显。结果表明,Ad5F35-IL24对U251细胞细胞周期进程有抑制作用,可使细胞周期被阻滞于G2/M期。同时,研究表明Ad5F35-IL24组可显著降低U251细胞的侵袭和迁移能力。结论:Ad5F35-IL24能够诱导人U251细胞凋亡,诱导G2/M期阻滞,降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。第三部分腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞ERK和p38 MAPK信号转导通路的影响目的:探讨外源性IL-24基因对U251胶质瘤细胞ERK和p38 MAPK信号转导通路的影响。方法:IL-24基因转染U251细胞24小时后,应用Western blot印迹检测细胞信号转导通路蛋白ERK、p-ERK、p38 MAPK和p-p38 MAPK的表达水平变化。同时,应用MTT、流式细胞术、双荧光染色观察ERK、p38 MAP蛋白抑制剂PD98059、SB203580作用后,对IL-24基因介导U251细胞杀伤作用的影响,以及细胞内相关蛋白表达水平的变化。结果:Western Blot结果表明:外源性IL-24基因作用于胶质瘤细胞U251后,p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表达(0.46±0.07, 0.60±0.07)明显增强(P<0.05)。将p38 MAPK抑制剂SB203580与Ad5F35-IL24合用后(20.83±1.34),较Ad5F35-IL24单用组(36.15±2.61)杀伤作用减弱(P<0.05)。ERK和p-ERK蛋白的与对照组相比没有显著改变(P>0.05)。ERK蛋白抑制剂PD98059与Ad5F35-IL24合用,能够提高IL-24基因对U251的杀伤作用(P<0.05)。结论:外源性IL-24基因对U251的选择性诱导凋亡作用,可能与其上调并激活p38 MAPK表达有关。而阻断ERK途径可进一步提高IL-24基因对肿瘤细胞的杀伤。第四部分腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞拓扑异构酶Ⅱα、bcl-2及caspase-3表达的影响目的:观察外源性IL-24基因对bcl-2、caspase-3以及拓扑异构酶Ⅱα表达(TopoⅡα)的影响。方法:应用Western blot印迹、RT-PCR、流式细胞术、免疫细胞化学的方法检测bcl-2、caspase-3和TopoⅡα蛋白的表达变化情况。结果:Western blot印迹结果表明,Ad5F35-IL24组TopoⅡα蛋白表达(0.48±0.03, 0.31±0.02)较对照组(1.35±0.07)和空载体VEC组(1.39±0.11, 1.26±0.06)表达减低(P<0.05)。且随IL-24基因表达浓度增高TopoⅡα表达随之减低。Ad5F35-IL24组bcl-2的表达(0.02±0.01)也较对照组(0.17±0.02)和空载体VEC组(0.18±0.01)表达减低(P<0.05)。Ad5F35-IL24组caspase-3蛋白的表达(0.71±0.09)较对照组(0.43±0.04)和空载体VEC组(0.47±0.02)表达增加(P<0.05)。流式细胞术检测表明,caspase-3表达增加,bcl-2表达降低(P<0.05)。Western blot印迹、RT-PCR、流式细胞术的方法观察到TopoⅡα表达降低,且与药物浓度增加成反比。免疫细胞化学检测发现TopoⅡα表达降低。结论:外源性IL-24基因杀伤U251细胞,TopoⅡα、bcl-2、caspase-3为其重要的作用靶点。研究结果为今后IL-24基因用于胶质瘤的临床治疗提供了实验资料。