本研究以pEGFP-C1为载体骨架,通过PCR扩增牛2.8kb的β-酪蛋白5’调控区及0.6 kb的3’侧翼区（poly A）序列作为调控序列,制备成含有绿色荧光和新霉素筛选标记的牛乳腺特异表达载体（PEPB）,经PCR和酶切鉴定正确后,用转染试剂FuGene HD将PEPB反复转染牛乳腺上皮细胞3-5次,用催乳素诱导后,经免疫荧光分析,检测目的蛋白在乳腺细胞中的表达。然后用PEPB载体电转染牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选得到阳性细胞后,把阳性细胞扩大培养并提取其基因组,因为Lysostaphin基因是外源基因,经PCR及southern blot检测,转基因克隆胚的制备与鉴定,为制备Lysostaphin基因的转基因克隆牛提供核供体细胞。结果表明,Lysostaphin基因在牛乳腺细胞正确表达,并整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组中,得到了转Lysostaphin基因的核供体细胞和转基因克隆胚。1.构建Lysostaphin基因原核表达载体,在原核表达系统成功表达了重组Lysostaphin蛋白,通过对其体外抑菌活性进行研究,证实重组Lysostaphin在体外具有很好的抑杀菌作用,可以作为功能基因制备转抗病基因动物2.利用PCR技术从牛的基因组中扩增β-酪蛋白5′（BBC5）和3′端（BBC3）序列,从PELY载体中扩增人生长激素信号肽和Lysostaphin成熟肽序列（Hgh-Lys）,首先并将BBC5和BBC3序列定向连接到初级乳腺特异表达载体PBCP中,构建成重组质粒PBCT,然后将Hgh-Lys和PBCT经过双酶切定向连接构建成PBS载体,最后将PBS与pEGFP-C1经过双酶切定向连接后,成功构建了Lysostaphin牛乳腺特异表达载体PEPB。3.利用FuGENE HD转染试剂,将经无内毒素纯化的PEPB质粒转入牛乳腺上皮细胞,经催乳素诱导后,经过免疫荧光组织化学及Western blot分析,表明PEPB载体能够介导Lysostaphin基因成熟肽序列在乳腺细胞中的表达。4.利用电转染的方法,将纯化的PEPB质粒转染牛胎儿成纤维细胞,24小时后观察绿色荧光的表达情况,同时加入G418进行筛选,得到阳性细胞后,提取细胞基因组进行PCR以及southern blot检测,证实目的基因已经整合到牛胎儿成纤维细胞基因组中,该阳性细胞可以用作转基因的核供体细胞。5.选取阳性克隆细胞,利用SCNT技术制备转基因克隆胚胎,选择具有绿色荧光表达的阳性克隆胚胎,经过PCR鉴定,说明转Lysostaphin基因核供体细胞制备成功。