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禽流感(Avian influenza,AI)是危害我国养禽业的重大传染病,是目前和今后禽病防控的重点。我国禽群中流行的禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)以低致病性H9N2亚型病毒为主。H9N2病毒的感染可导致鸡不同程度的呼吸道症状,产蛋鸡产蛋量下降约10-20%,而且可造成鸡免疫抵抗力下降,感染鸡容易并发或继发其它各种细菌和病毒性疾病。H9N2病毒可以在种间传播,给人类的生命安全造成严重的威胁。H9N2亚型AIVs还是感染人类的新型流感病毒的“母病毒”,为国内流行的鸡源H5N1和H7N9病毒提供了6个内部基因片段。这些含H9N2病毒基因的新病毒对哺乳动物的感染性增强,公共卫生学意义越来越明显。因此,做好家禽H9N2亚型AIVs感染的防控工作意义重大。目前,疫苗免疫是我国防控禽流感的主要手段。AIVs亚型众多,变异频繁,给疫苗的研发带来了巨大的困难。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是新型流感疫苗研究的一种策略,该疫苗不依赖于传统的鸡胚生产系统,而采用体外细胞培养制备病毒抗原。VLPs具有与病毒粒子相似的天然构象,因其不含有病毒的基因组,因此具有更高的安全性。本研究以H9N2亚型禽流感病毒中的57基因型为研究对象,选取HA、NA、M1共表达的方式进行VLP的构建。本研究首先构建重组转移载体pFBDHA-NA-M1共表达载体,使用p FastBac Dual载体,将M1基因克隆到P10启动子下游,将HA、NA两个基因克隆到PpH启动子下游,即pFBD-HA-NA-M1。重组转移质粒p FBD-HA-NA-M1转化至E.coli DH10Bac感受肽细胞,通过转座将插入的目的片段转移到重组杆状病毒DNA上。然后,通过蓝白斑筛选及PCR鉴定后便得到了重组杆粒rBacmid-HA-NA-M1。将杆粒转染至Sf21昆虫细胞,27℃培养72小时后收获上清。将上清盲传3代后,通过Western-blot、电镜观察等方法进行蛋白表达及VLP组装的鉴定。Western-blot检测发现:在62KD、54KD、30KD处检测出明显的蛋白条带,电镜观察结果表明,本研究获得了与病毒颗粒外观相似的,大小在100 nm左右的球状颗粒。本研究成功利用昆虫杆状病毒表达系统,以三种结构蛋白组装成了H9N2亚型的病毒样颗粒,为今后的疫苗研究奠定了基础。