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研究目的：
冬眠动物在长达几个月的冬眠中，骨骼肌处于不活动或极少活动的状态，这个状态会引起非冬眠动物的废用性肌肉萎缩，而冬眠动物在出眠时并没有发生明显的废用性萎缩，其机制尚不明了。有关非冬眠动物的研究表明，肌萎缩主要是因为肌蛋白降解增加和细胞凋亡的发生。胞浆钙超载不仅能激活钙蛋白酶信号通路引起蛋白降解，并且能激活细胞凋亡信号通路，引起细胞凋亡。所以本研究从细胞凋亡调控，蛋白降解与钙稳态调控三个方面对冬眠不同时期达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)比目鱼肌细胞进行了研究，探讨其抗废用性肌肉萎缩的分子机制。
钙稳态是内环境稳态的重要组成部分。钙稳态失衡是激活Calpains钙蛋白酶系统，进而降解蛋白，导致废用性肌萎缩的主要机制之一。调节细胞内钙稳态的因素主要有降钙与升钙两方面，降钙因素主要有三个，第一个是位于肌质网膜上的钙泵SERCA2 (Ca2+ATPase)，能将胞浆中的钙离子泵回肌质网，是降低细胞内钙离子浓度的重要因素；第二个是位于细胞膜上的钠钙交换体NCX (Na+-Ca2+ exchanger)，可以将钠离子转入细胞内，将钙离子转出细胞，从而起到降低细胞内钙离子浓度的作用；第三个是钙离子结合蛋白CALMI (calmodulin)，能与胞浆中的钙离子结合，从而降低细胞内游离的钙离子浓度；升钙因素主要有两个，一个是细胞膜上的L型钙离子通道，由于该通道是电压门控通道，跨膜电位是影响该通道的主要因素，因此本研究中没有对其基因表达进行研；另一个是线粒体上的H+-Ca2+转换子LETAL (EF hand-containing transmembrane protein1)，能把线粒体中钙离子释放到细胞质中，可以避免线粒体钙超载，同时增加了胞浆钙离子浓度。骨骼肌细胞的钙稳态是细胞浆、肌质网与线粒体基质钙离子之间的动态平衡，主要由以上提及的钙通道、钙泵、钙离子结合蛋白以及离子交换体等协同完成。本研究选取了细胞膜上的NCX、肌质网SERCA2、线粒体LETAL以及胞浆的钙离子结合蛋白CALMI，从基因表达的角度，系统研究冬眠对骨骼肌钙稳态的影响。
细胞凋亡信号通路中选择了抑凋亡因子Bcl-2，促凋亡因子Bax和半胱氨酸Caspase-3。Bcl-2蛋白和Bax蛋白均属于Bcl-2家族，前者是抗凋亡蛋白，后者是促凋亡蛋白，二者蛋白水平的高低与凋亡调控直接相关。Bcl-2与Bax形成的异源二聚体中二者的比例决定细胞到底该向存活还是死亡的方向发展。Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，其激活底物多聚合酶，能剪切核小体上的DNA，从而引起细胞凋亡。
蛋白水解信号通路中选择了钙蛋白酶Calpain-1，Calpain-2和钙蛋白酶抑制剂Calpastatin。钙蛋白酶是存在于细胞质中的Ca2+依赖性的半胱氨酸蛋白水解酶，以往研究表明，在骨骼肌蛋白降解过程中，首先是激活Calpain，活化的Calpain会降解细胞骨架蛋白，使肌原纤维从细胞骨架上脱落，然后通过依赖ATP的泛素-蛋白酶水解系统降解成氨基酸。钙蛋白酶抑制剂Calpastatin能特异性地抑制钙蛋白酶Calpain-1和Calpain-2的活性。因为本实验室之前已经对其蛋白表达进行了研究，这次只从基因表达的角度进行研究。
研究方法：
达乌尔黄鼠(n=24)被划分为四组：冬眠前(PRE，n=6)；冬眠中组(HIB，n=6，经过60天的冬眠)；阵间激醒组(IBA，n=6)；出眠组(POST，n=6，经过90±12天的冬眠，出眠后两天)；应用western-blot方法检测Bax，Bcl-2和Caspase-3的蛋白表达变化，应用荧光定量PCR方法检测Bax，Bcl-2，Calpain-1，Calpain-2，Calpastatin，NCX，SERCA2，LETAL和CALM1的基因表达变化，应用电子显微镜观察比目鱼肌细胞Z线的超微结构。
研究结果：
1．与冬眠前组相比，冬眠中组与出眠组黄鼠的体重分别下降了24%(p＜0.05)和38%(p＜0.05)；比目鱼肌湿重分别下降了9%(p＜0.05)和16%(p＜0.05)。与冬眠前组相比，冬眠中组与出眠组比目鱼肌肌重体重比分别升高了33%(p＜0.001)和59%(p＜0.001)。
2．与冬眠前组相比，冬眠中组与出眠组比目鱼肌细胞Z线排列整齐，Z线的宽度没有明显的变化。
3．与冬眠前组相比，冬眠中组，阵间激醒组和出眠组抗凋亡基因Bcl-2的表达水平分别升高了74.4%(p＜0.001)，106.6%(p＜0.001)和48.8%(p＜0.001)；冬眠中组和阵间激醒组促凋亡基因Bax的表达水平分别升高了85%(p＜0.001)和55%(p＜0.001)；冬眠中组和阵间激醒组促凋亡基因Bax与抗凋亡基因Bcl-2的比值分别降低了18%(p＜0.001)和26%(p＜0.001)，出眠组的Bax／Bcl-2则无显著变化。
4．与冬眠前组相比，冬眠中组，阵间激醒组和出眠组抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表达水平分别升高了500%(p＜0.001)，262%(p＜0.05)和385%(p＜0.001)；与冬眠前组相比，冬眠中组促凋亡基因Bax的蛋白表达水平降低了58%(p＜0.001)；与冬眠前组相比，阵间激醒组Caspase-3蛋白表达升高了29%(p＜0.001);与冬眠前组相比，冬眠中组促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的比值降低了92%(p＜0.001)。
5．与冬眠前组相比，冬眠中组，阵间激醒组和出眠组钙蛋白酶抑制剂Calpastatin基因的表达水平分别升高了61%(p＜0.001)，111.3%(p＜0.001)和69.6%(p＜0.001)。
6．与冬眠前组相比，冬眠中组，阵间激醒组和出眠组SERCA2基因的表达水平分别增加了50.3%(p＜0.05)，131.5%(p＜0.001)和36.6%(p＜0.001)；钙离子结合蛋白CALM1基因的表达水平分别增加了18.2%(p＜0.05)，33.9%(p＜0.001)和32.5%(p＜0.001)；与冬前组相比，冬眠中组钠钙交换体NCX基因表达降低了19.7%(p＜0.05)；与冬眠中组相比，阵间激醒组线粒体上的H+-Ca2+转换子LETA1基因表达增加了43%(p＜0.05)。
研究结论：
1．冬眠黄鼠比目鱼肌湿重下降幅度小于体重的下降幅度，支撑单位体重的比目鱼肌重量出现上升。
2．冬眠黄鼠比目鱼肌细胞Z线的超微结构没有发生明显的退行性变化。
3．冬眠黄鼠能通过上调抗凋亡因子Bcl-2的基因表达和蛋白表达水平，主动抑制比目鱼肌细胞凋亡的发生。
4．冬眠黄鼠能通过上调钙蛋白酶抑制剂Calpastatin的表达水平，主动抑制Calpain-1和Calpain-2的活性，防止骨骼肌蛋白的降解。
5．冬眠黄鼠能通过上调肌质网膜上的钙泵SERCA2和细胞质中的钙离子结合蛋白CALM1的基因表达水平，从而防止细胞内钙超载的发生，阵间激醒时线粒体LETA1基因表达水平的升高可以避免线粒体基质钙离子超载。
总之，冬眠达乌尔黄鼠能通过维持骨骼肌细胞的钙稳态，避免钙超载，从而避免Calpain激活，避免骨骼肌蛋白的降解。另一方面，胞浆钙稳态的维持与抗凋亡因子Bcl-2的显著上调，协同抑制细胞凋亡的发生。
冬眠动物在长达几个月的冬眠中，骨骼肌处于不活动或极少活动的状态，这个状态会引起非冬眠动物的废用性肌肉萎缩，而冬眠动物在出眠时并没有发生明显的废用性萎缩，其机制尚不明了。有关非冬眠动物的研究表明，肌萎缩主要是因为肌蛋白降解增加和细胞凋亡的发生。胞浆钙超载不仅能激活钙蛋白酶信号通路引起蛋白降解，并且能激活细胞凋亡信号通路，引起细胞凋亡。所以本研究从细胞凋亡调控，蛋白降解与钙稳态调控三个方面对冬眠不同时期达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)比目鱼肌细胞进行了研究，探讨其抗废用性肌肉萎缩的分子机制。
钙稳态是内环境稳态的重要组成部分。钙稳态失衡是激活Calpains钙蛋白酶系统，进而降解蛋白，导致废用性肌萎缩的主要机制之一。调节细胞内钙稳态的因素主要有降钙与升钙两方面，降钙因素主要有三个，第一个是位于肌质网膜上的钙泵SERCA2 (Ca2+ATPase)，能将胞浆中的钙离子泵回肌质网，是降低细胞内钙离子浓度的重要因素；第二个是位于细胞膜上的钠钙交换体NCX (Na+-Ca2+ exchanger)，可以将钠离子转入细胞内，将钙离子转出细胞，从而起到降低细胞内钙离子浓度的作用；第三个是钙离子结合蛋白CALMI (calmodulin)，能与胞浆中的钙离子结合，从而降低细胞内游离的钙离子浓度；升钙因素主要有两个，一个是细胞膜上的L型钙离子通道，由于该通道是电压门控通道，跨膜电位是影响该通道的主要因素，因此本研究中没有对其基因表达进行研；另一个是线粒体上的H+-Ca2+转换子LETAL (EF hand-containing transmembrane protein1)，能把线粒体中钙离子释放到细胞质中，可以避免线粒体钙超载，同时增加了胞浆钙离子浓度。骨骼肌细胞的钙稳态是细胞浆、肌质网与线粒体基质钙离子之间的动态平衡，主要由以上提及的钙通道、钙泵、钙离子结合蛋白以及离子交换体等协同完成。本研究选取了细胞膜上的NCX、肌质网SERCA2、线粒体LETAL以及胞浆的钙离子结合蛋白CALMI，从基因表达的角度，系统研究冬眠对骨骼肌钙稳态的影响。
细胞凋亡信号通路中选择了抑凋亡因子Bcl-2，促凋亡因子Bax和半胱氨酸Caspase-3。Bcl-2蛋白和Bax蛋白均属于Bcl-2家族，前者是抗凋亡蛋白，后者是促凋亡蛋白，二者蛋白水平的高低与凋亡调控直接相关。Bcl-2与Bax形成的异源二聚体中二者的比例决定细胞到底该向存活还是死亡的方向发展。Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，其激活底物多聚合酶，能剪切核小体上的DNA，从而引起细胞凋亡。
蛋白水解信号通路中选择了钙蛋白酶Calpain-1，Calpain-2和钙蛋白酶抑制剂Calpastatin。钙蛋白酶是存在于细胞质中的Ca2+依赖性的半胱氨酸蛋白水解酶，以往研究表明，在骨骼肌蛋白降解过程中，首先是激活Calpain，活化的Calpain会降解细胞骨架蛋白，使肌原纤维从细胞骨架上脱落，然后通过依赖ATP的泛素-蛋白酶水解系统降解成氨基酸。钙蛋白酶抑制剂Calpastatin能特异性地抑制钙蛋白酶Calpain-1和Calpain-2的活性。因为本实验室之前已经对其蛋白表达进行了研究，这次只从基因表达的角度进行研究。
研究方法：
达乌尔黄鼠(n=24)被划分为四组：冬眠前(PRE，n=6)；冬眠中组(HIB，n=6，经过60天的冬眠)；阵间激醒组(IBA，n=6)；出眠组(POST，n=6，经过90±12天的冬眠，出眠后两天)；应用western-blot方法检测Bax，Bcl-2和Caspase-3的蛋白表达变化，应用荧光定量PCR方法检测Bax，Bcl-2，Calpain-1，Calpain-2，Calpastatin，NCX，SERCA2，LETAL和CALM1的基因表达变化，应用电子显微镜观察比目鱼肌细胞Z线的超微结构。
研究结果：
1．与冬眠前组相比，冬眠中组与出眠组黄鼠的体重分别下降了24%(p＜0.05)和38%(p＜0.05)；比目鱼肌湿重分别下降了9%(p＜0.05)和16%(p＜0.05)。与冬眠前组相比，冬眠中组与出眠组比目鱼肌肌重体重比分别升高了33%(p＜0.001)和59%(p＜0.001)。
2．与冬眠前组相比，冬眠中组与出眠组比目鱼肌细胞Z线排列整齐，Z线的宽度没有明显的变化。
3．与冬眠前组相比，冬眠中组，阵间激醒组和出眠组抗凋亡基因Bcl-2的表达水平分别升高了74.4%(p＜0.001)，106.6%(p＜0.001)和48.8%(p＜0.001)；冬眠中组和阵间激醒组促凋亡基因Bax的表达水平分别升高了85%(p＜0.001)和55%(p＜0.001)；冬眠中组和阵间激醒组促凋亡基因Bax与抗凋亡基因Bcl-2的比值分别降低了18%(p＜0.001)和26%(p＜0.001)，出眠组的Bax／Bcl-2则无显著变化。
4．与冬眠前组相比，冬眠中组，阵间激醒组和出眠组抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表达水平分别升高了500%(p＜0.001)，262%(p＜0.05)和385%(p＜0.001)；与冬眠前组相比，冬眠中组促凋亡基因Bax的蛋白表达水平降低了58%(p＜0.001)；与冬眠前组相比，阵间激醒组Caspase-3蛋白表达升高了29%(p＜0.001);与冬眠前组相比，冬眠中组促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的比值降低了92%(p＜0.001)。
5．与冬眠前组相比，冬眠中组，阵间激醒组和出眠组钙蛋白酶抑制剂Calpastatin基因的表达水平分别升高了61%(p＜0.001)，111.3%(p＜0.001)和69.6%(p＜0.001)。
6．与冬眠前组相比，冬眠中组，阵间激醒组和出眠组SERCA2基因的表达水平分别增加了50.3%(p＜0.05)，131.5%(p＜0.001)和36.6%(p＜0.001)；钙离子结合蛋白CALM1基因的表达水平分别增加了18.2%(p＜0.05)，33.9%(p＜0.001)和32.5%(p＜0.001)；与冬前组相比，冬眠中组钠钙交换体NCX基因表达降低了19.7%(p＜0.05)；与冬眠中组相比，阵间激醒组线粒体上的H+-Ca2+转换子LETA1基因表达增加了43%(p＜0.05)。
研究结论：
1．冬眠黄鼠比目鱼肌湿重下降幅度小于体重的下降幅度，支撑单位体重的比目鱼肌重量出现上升。
2．冬眠黄鼠比目鱼肌细胞Z线的超微结构没有发生明显的退行性变化。
3．冬眠黄鼠能通过上调抗凋亡因子Bcl-2的基因表达和蛋白表达水平，主动抑制比目鱼肌细胞凋亡的发生。
4．冬眠黄鼠能通过上调钙蛋白酶抑制剂Calpastatin的表达水平，主动抑制Calpain-1和Calpain-2的活性，防止骨骼肌蛋白的降解。
5．冬眠黄鼠能通过上调肌质网膜上的钙泵SERCA2和细胞质中的钙离子结合蛋白CALM1的基因表达水平，从而防止细胞内钙超载的发生，阵间激醒时线粒体LETA1基因表达水平的升高可以避免线粒体基质钙离子超载。
总之，冬眠达乌尔黄鼠能通过维持骨骼肌细胞的钙稳态，避免钙超载，从而避免Calpain激活，避免骨骼肌蛋白的降解。另一方面，胞浆钙稳态的维持与抗凋亡因子Bcl-2的显著上调，协同抑制细胞凋亡的发生。