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[目 的]新生儿缺氧缺血性脑病(Neonatal hypoxic ischemic encephalopathy,NHIE)诱导脑细胞发生不可逆转的神经损伤,导致严重的后遗症和不可预测的影响。SNAP25在神经突触递质传递中有重要协调作用,缺乏SNAP25会导致记忆障碍及神经功能受损。所以,本文将分为体内和体外两部分研究SNAP25在新生脑缺氧缺血(hypoxia-ischemia,HI)大鼠中发挥的作用,并阐述SNAP25发挥其功能的潜在关联分子。[方 法]本文分为体内和体外进行实验,全面阐明SNAP25在HI中发挥作用。体内:新生7天SD大鼠右颈总动脉被凝断并缺氧2h以建立体内HI模型。TTC染色观察HI后24h脑梗死情况;Zea-longa评分评估HI模型是否成功;NEUN免疫荧光染色检测HI后24h神经元阳性细胞数;HE染色观察HI后24h和30d脑皮质的组织细胞情况;水迷宫、Y迷宫检测HI后30d大鼠记忆功能,旷场评估HI后30d的焦虑状态,NSS评分对30d大鼠神经功能进行评价,转棒实验评价HI后30d大鼠运动和平衡能力。最后,qRT-PCR和WB检测HI后24h的SNAP25在皮质表达相对量。体外:建立体外氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)模型,qRT-PCR 检测 OGD2h 和 3h 的 SNAP25-mRNA 表达以确定OGD模型时间。在NCBI中查找SNAP25的双链RNA(dsRNA)序列,交由广州锐博公司设计制备3个RNA片段和一个无意义片段(NC)。用新生SD大鼠培养原代皮质神经元并复苏PC12细胞,在原代皮质神经元和PC12细胞中转染SNAP25-siRNA 阳性对照(CY3)观察转染效率和筛选3个干扰片段中最有效的干扰片段,qRT-PCR检测最有效的SNAP25-siRNA片段后再次转染到原代皮质神经元,建立体外OGD模型,免疫荧光观察细胞形态并检测细胞大小、轴突长度和神经元数量。最后,通过GENEMANIA软件查找SNAP25关联分子,qRT-PCR检测SNAP25发挥功能的关联分子。[结 果]体内:我们发现与sham组比较,在TTC染色HI后24h右皮质有明显梗死区(P<0.05),HI组Zea-longa评分明显升高(P<0.05),NEUN阳性细胞数也减少(P<0.05)。HE染色发现HI后24h脑皮质神经细胞有凋亡且胞浆疏松淡染,神经细胞排列紊乱,HI后30d神经细胞大片死亡,有核固缩,胞浆甚至出现空洞。水迷宫实验发现HI后30d,HI组大鼠的逃避潜伏期时间比sham组明显增加(P<0.05),但是穿过平台次数、目标象限路程百分比和时间百分比都比sham组减少(P<0.05),表明HI后大鼠发生记忆障碍;Y迷宫发现HI组大鼠的错误率和错误臂停留时间比sham组增加(P<0.05),正确率和食物臂停留时间比sham组减少(P<0.05),表明HI后大鼠有学习记忆损伤;旷场实验发现HI组大鼠的站立时间和理毛时间与sham组相比显著减少(P<0.05),表明HI后大鼠有抑郁样情绪出现;NSS评分结果显示与sham组比较,HI组的评分升高(P<0.05),表明HI后大鼠神经功能受损;转棒疲劳实验显示HI后30d,大鼠在转棒上的运动时间较sham组减少(P<0.05),表明HI后大鼠运功功能有损伤。qRT-PCR结果显示SNAP25-mRNA相对表达量在右皮质较sham组增加(P<0.05),左皮质、左海马和右海马的SNAP25也均升高,但是没有统计学意义。WB发现与sham组比较,HI组的SNAP25蛋白质相对表达量在右皮质升高(P<0.05),表明HI后SNAP25的表达在右皮质增加。体外:qRT-PCR检测发现OGD 2h组比单纯缺氧组的SNAP25-mRNA表达量升高,OGD 3h 比 OGD 2h的SNAP25-mRNA表达量降低,最终我们选定2h为OGD实验时间。转染SNAP25-siRNA的3个片段后发现F1片段的SNAP25-mRNA表达量较normal组明显下降(P<0.05),故选取F1片段为最有效干扰片段。原代皮质神经元和PC12细胞转染有效片段后发现在正常条件和OGD条件下,SNAP25-si组的SNAP25-mRNA表达量下降(P<0.05),CY3转染效率达80%,表明成功沉默SNAP25基因。免疫荧光染色发现在正常条件和OGD条件下,与sham组相比,OGD组神经元的数量和细胞胞体面积及轴突长度都减少(P<0.05);与NC组相比,SNAP25-si组神经元的轴突长度和细胞胞体面积及细胞数量也都减少(P<0.05),表明沉默SNAP25后神经元受损情况加重,另一方面也说明了 SNAP25可能发挥神经元保护作用。最后,我们筛选到了 11个与SNAP25有关联的分子,分别是Bcl-2、NGF、VEGF、CREB、SNCB、SYP、STAT3、ERKI、AKT、JAK1、PI3K,检测后发现与NC组相比,正常条件下SNAP25-si组Bcl-2,NGF和VEGF表达增加(P<0.05),CREB 和 SYP 表达减少(P<0.05);在 OGD 条件下 SNAP25-siRNA组NGF表达增加(P<0.05),CREB,SNCB和SYP表达下降(P<0.05),同时,SNAP25干扰后在正常条件下STAT3和ERK1的表达增加(P<0.05)。[结 论]我们成功构建了体内HI模型和体外OGD模型,验证了沉默SNAP25加重神经元损伤,同时提示SNAP25可能有保护神经元的作用,我们认为SNAP25在新生HIE大鼠中发挥其功能可能与下调STAT3和ERK1以及上调CREB有关,本研究为SNAP25在新生儿缺血缺氧性脑病的功能研究提供了新思路。