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牙周炎伴随着炎症和牙槽骨吸收,牙周炎症的进展可能导致牙齿缺失。为了恢复缺失的牙周组织,一些治疗手段如引导组织再生,植骨术和应用釉基质蛋白衍生物等已经在实验动物和临床上开展使用。但是,在临床实践中很难观察到令人满意的牙周组织再生。低强度脉冲超声(Low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)是一种非创伤性的强度在30到100 m W/cm2的声辐射。基础和临床研究发现,LIPUS可以加速骨折愈合。基于这样的发现,越来越多的研究开始关注它对于牙周疾病的疗效。有研究报道机械应力能引起一系列细胞反应如细胞增殖、细胞分化和细胞迁移。LIPUS能以声波的形式向细胞和组织传递机械能量,因而可能具有类似机械能的功能,本研究主要集中于LIPUS对干细胞的迁移和募集作用,这也许会成为牙周治疗的新靶点。基质细胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor 1,SDF-1)或趋化因子CXCL12(C-X-C motif chemokine ligand 12,CXCL12)是一种被多种组织表达的趋化因子。在组织/器官损伤的情况下,SDF-1能促进干细胞或者祖细胞募集到损伤部位,调节细胞迁移、增殖和分化,SDF-1/CXCL4信号通路在损伤的修复过程中扮演重要角色。有研究发现,SDF-1可以促进h PDLSCs增殖、迁移,促进COL-I表达。以往研究表明,SDF-1在干细胞归巢和组织再生过程中发挥了重要的作用。TWIST相关蛋白1(Twist-related protein 1,TWIST1)编码一个基本的螺旋-环-螺旋转录因子。体内体外实验研究表明TWIST1基因参与上皮间充质转化、肿瘤侵袭和进展、间充质细胞分化、中胚层和肌肉组织发育、人颅缝早闭等。在咬合力的作用下,TWIST1可能与牙槽骨-牙周膜复合体的功能相关,在牙周塑形中起着调节作用。TWIST1与SDF-1的表达增加有着剂量依赖关系。TWIST1被发现能直接激活SDF-1表达,促进细胞迁移。这些结果提示TWIST1及SDF1/CXCR4信号通路可能参与LIPUS促进干细胞迁移及归巢生物效应的信号转导过程。在本研究中,我们主要关注TWIST1是否为LIPUS的一种机械应力的感受器,LIPUS能否调控SDF1/CXCR4信号通路,增强干细胞迁移和归巢作用,从而促进牙周组织修复再生。体外细胞实验:从人前磨牙根面收集牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,h PDLSCs)。使用流式细胞术和多向分化实验鉴定h PDLSCs。h PDLSCs经过LIPUS处理以后,采用RTPCR实验分别检测不阻断和阻断SDF-1/CXCR4信号通路组(加入AMD3100)的SDF-1表达水平。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测h PDLSCs中SDF-1的分泌水平。使用划痕实验和Transwell实验检测LIPUS对h PDLSCs迁移能力的影响作用。通过si RNA转染技术干扰h PDLSCs的TWIST1表达,来探索LIPUS生物效应的信号传递机制。结果显示LIPUS在m RNA水平和蛋白水平均能提升TWIST1和SDF-1的表达水平,并且,LIPUS加强了h PDLSCs的迁移能力。抑制TWIST1基因后,SDF-1的表达和h PDLSCs的迁移能力均降低,表明TWIST1可能是SDF-1上游的调控因子。总之,这些发现提示SDF1/CXCR4信号通路参与调控了LIPUS对PDLSCs迁移的促进作用,这是LIPUS介导牙周再生的可能机制之一。而在LIPUS信号传导过程中,TWIST1可能是一种机械应力的感受器。体内动物实验:将分离培养获得的大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal stem cells,BMSCs)进行慢病毒转染(LUC+GFP),获得稳定表达LUC+GFP基因的大鼠BMSCs,用于后续动物实验。我们选用6周龄大鼠,分为四组:空白组、缺损组、缺损+BMSCs组、缺损+BMSCs+LIPUS组(n=5)。将各实验组动物建立急性牙周缺损模型,通过鼠尾静脉注射将标记后的大鼠BMSCs输入大鼠体内,在术后24小时、3天、1周、4周进行活体生物荧光成像检测,观察标记的大鼠BMSCs在大鼠体内的分布情况,并通过HE染色、Masson染色等观察牙周组织修复情况。采用免疫组化检测缺损处骨桥蛋白(OPN)及I型胶原(COLI)的表达,进一步证明以上的结果。大鼠活体成像结果显示,在未注入细胞的对照组和单纯缺损组,没有检测到荧光信号。而在注入了BMSCs的两组中,大鼠四肢、内脏、颌面部均能检测到荧光信号,而进行了下颌骨局部LIPUS辐照的大鼠,颌面部荧光信号更强。HE染色以及Masson染色结果显示,LIPUS辐照组具有更多的新骨形成。免疫组化染色结果也显示缺损区内可见较多COLI及OPN阳性细胞,而在新骨形成越活跃的地方,COLI和OPN表达越强。实验结果显示,在急性牙周缺损状态下,LIPUS可以促进更多的大鼠BMSCs迁移至缺损处,参与缺损修复。并可能通过旁分泌作用,促进血管形成,促进新骨形成,从而促进牙周组织修复再生。