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雌激素对内脏痛觉感受存在着重要的调节作用,正常情况下女性体内外周合成雌激素水平在不同生理阶段有着较大的波动,这可以直接导致在特定时期女性痛觉敏感化的发生,而在中枢神经系统还存在着雌激素的局部合成,其功能、相应机制和存在意义我们还知之甚少,需要进行更深入的研究。G蛋白偶联受体30(G-protein coupledreceptor30,GPR30)有别于经典雌激素核受体ERα和ERβ,是位于细胞膜或细胞器膜结构上的雌激素受体,可介导雌激素快速的非基因组效应。延髓头端腹内侧区(Rostral ventromedial medulla,RVM)是中枢神经系统痛觉下行调控通路的重要组成部分,是内源性阿片肽发挥镇痛功能的主要作用区域之一,是痛觉下行调控系统的最后一个功能性核团,直接调控痛觉信息在脊髓后角的传递过程。 我们实验室前期工作已经证明RVM区域微量注射雌激素,对大鼠肠道痛觉有着显著的易化作用,RVM核心区域中缝大核有GPR30的高表达,而ERα和ERβ的表达则极少。这些结果提示雌激素可能是通过GPR30在RVM区域发挥对外周痛觉感受的调控作用。本课题就是在前期工作的基础上,明确雌激素在RVM区域发挥作用的受体机制,研究雌激素对内源性阿片肽镇痛系统的影响及其作用方式,最后,我们在由环磷酰胺诱导慢性膀胱炎引发的肠道痛觉增敏病理模型(中枢性肠道痛敏模型)大鼠上,探讨RVM区域GPR30信号通路在中枢性内脏痛敏发生中的作用。 主要实验结果如下: 一、RVM区域GPR30激活增强正常大鼠肠道痛敏 我们首先证实芳香化酶和GPR30在RVM区域神经元上存在阳性表达,而且在部分神经元上有共表达;利用Western blot的方法确认GPR30是RVM区域主要存在的雌激素受体类型;向大鼠RVM核心区域中缝大核微量注射GPR30特异性激动剂G1,可显著增强正常大鼠肠道的痛觉反应,说明GPR30受体激活可以介导雌激素在RVM区域对外周肠道痛敏的易化作用。 二、GPR30通过抑制μ型阿片受体功能发挥痛觉易化作用 大鼠在体电生理实验研究发现,激活RVM区域中缝大核的GPR30几乎可以完全拮抗外源性吗啡在该区域原本能够发挥的强大镇痛作用;而在离体延髓脑片上,运用全细胞膜片钳记录的方法证明RVM区域μ型阿片受体介导的外向电流可以被GPR30激活所抑制;进一步利用Western blot方法分析证实,GPR30激活是通过引起RVM区域μ型阿片受体的磷酸化,从而抑制其镇痛功能。 三、胞内钙离子介导GPR30对μ型阿片受体功能的抑制作用 在原代培养的RVM区域神经元上,激活存在于高尔基体上的GPR30可引起胞内钙离子释放,产生一个明显的钙信号;而在延髓脑片上,利用电极内给药的方法螯合胞内钙离子,可阻断GPR30激活对μ型阿片受体介导外向电流的抑制作用;进一步,在延髓脑片上,螯合胞内钙离子,可以完全阻断GPR30激活引起的μ型阿片受体磷酸化。 四、RVM区域雌激素——GPR30信号通路增强参与肠道中枢性痛敏的发生 我们利用环磷酰胺诱导大鼠慢性膀胱炎,部分大鼠肠道在无明显外周炎症反应的情况下出现痛觉高敏,这种肠道痛敏模型我们称为“中枢性肠道痛敏模型”。在该模型上,利用Western blot的方法检测发现RVM区域芳香化酶、GPR30和磷酸化μ型阿片受体的表达均明显升高;大鼠在体RVM区域给予GPR30阻断剂G15抑制受体功能,可降低模型大鼠RVM区域μ型阿片受体磷酸化水平;而大鼠RVM区域给予G15后,在体电生理记录显示大鼠肠道痛觉高敏情况可被显著抑制。 综上所述,本课题在实验室前期工作基础上,首先明确了在RVM区域神经元上表达的GPR30介导了雌激素对肠道痛敏的易化作用,激活GPR30可显著抑制RVM区域μ型阿片受体介导的镇痛功能;进一步的,我们发现GPR30激活可通过引起胞内钙离子释放增加导致μ型阿片受体磷酸化,胞内钙信号参与介导GPR30对μ型阿片受体功能的调控;最后,在中枢性肠道痛敏模型大鼠上,抑制RVM区域GPR30功能可很大程度上降低肠道的痛觉敏感性,从另一方面说明雌激素——GPR30信号通路在该区域的重要作用。本研究为深入理解雌激素在RVM区域发挥痛觉调控功能的机制,痛觉下行调控通路中GPR30对μ型阿片受体功能的调控方式,以及中枢神经系统与内分泌激素功能的相互作用提供更详实的实验依据。