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Harpin是一类能够在植物上发挥多种功能的蛋白,关于harpin蛋白在植物体内的作用位点至今仍存在不同的观点,研究人员推测:不同的harpin蛋白在植物体内可能存在不同的互作靶标,亦或是同一种harpin蛋白其互作靶标不止一个。本实验室利用膜酵母双杂交系统,在拟南芥的cDNA文库中筛选到6个不同的阳性克隆,其中就包括拟南芥水通道蛋白AtPIP1;4,并发现它能够与黄单胞Ⅲ型分泌系统转位子蛋白Hpa1xoo发生特异性的互作,从而调控拟南芥的C02运输与光合作用。经序列比对发现,水稻质膜嵌入蛋白OsPIP1家族同拟南芥水通道蛋白AtPIP1;4的其同源性高达75%以上,因此我们推测,在水稻OsPIP1蛋白家族中可能存在能够与Hpa1xoo发生特异性互作的成员。利用膜酵母双杂交体系、双分子荧光互补、免疫共沉淀等蛋白质互作鉴定技术,我们发现水稻质膜嵌入蛋白OsPIP1家族中的OsPIP1;3能够与Hpa1xoo发生特异性的互作,而OsPIP1;1或OsPIP1;2不能。为了进一步探究OsPIP1;3与Hpa1Xoo互作的分子基础,探寻介导两者特异性互作的关键功能域,首先我们将OsPIP 1;3的不同分段功能域与OsPIP 1;1对应的功能域进行替换,并用融合PCR法构建出相应的突变体,用SB-Y2H、Co-IP以及水稻原生质体BiFC等蛋白质互作技术进行研究,结果发现,OsPIP1;3的LE片段是介导Hpa1与OsPIP1;3特异性互作的关键功能域;之后我们又利用融合PCR法构建了hpa1不同功能域的缺失基因突变体,分别是:hp△N36、hpa1 △Na、hpa1△Ca以及hpa1△NCα,继而利用膜酵母双杂交、免疫共沉淀以及水稻原生质体BiFC等蛋白质互作验证技术,发现位于Hpa1xoo蛋白N、C两端的α-螺旋是与OsPIP1;3作的关键功能域。