研究背景：蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)指脑底部或脑表面的病变血管破裂,血液直接流入蛛网膜下腔引起的一种临床综合征,具有较高的死亡率,致残率,是一种非常严重及常见的疾病。12.4%的患者在送到医院之前就已经死亡,另外大约40%到50%的患者在发病后头30天内死亡。此外,在能够生存下来的患者中,还有10%到20%的患者遭受严重的神经功能障碍。SAH造成的脑损伤不仅给患者家庭带来严重的情感伤害,还给社会和家庭带来很重的经济负担。虽然随着近年来在动脉瘤腔内血管技术、诊断方法、围手术期处理及手术技巧等方面都有了明显进步,但因SAH引起的致死致残率仍无明显改善。SAH后复杂的病理过程以及其精确的调控机制至今仍然不完全清楚,目前认为,SAH发生后脑内的变化包括：颅内压升高、脑血流量降低、脑灌注压降低、血脑屏障破坏、脑肿胀、脑水肿、严重的脑血管痉挛以及自身调节功能障碍等。SAH发病后72h内发生的包括上述一系列的改变造成的直接损害,称之为早期脑损伤(EBI)。在这期间颅内的这些变化会引起许许多多的分子激活,包括炎症介质、细胞凋亡介质以及内源性保护因子等。SAH后颅内的病理过程可以激活许多的内源性保护因子,发挥脑保护作用。充分挖掘这些内源性脑保护因子的潜力,特别是在神经元中表达的保护因子,可能成为降低SAH引起的死残率新的治疗方向。脑红蛋白(Neuroglobin,Ngb),又叫神经球蛋白,由德国科学家Burmester于2000年首次在小鼠神经系统内发现的一类新的球蛋白,以神经系统内广泛表达为主。自Ngb被发现以来,很快掀起了一股研究热潮,人们对其结构、分子机制以及脑保护作用进行了大量的研究。研究发现Ngb是一种含血红色的单一亚基蛋白质,并且有21%的序列跟脊椎动物肌红蛋白相似,25%的序列跟血红蛋白相似。然而,跟肌红蛋白和血红蛋白不同的是,Ngb两端并处于血红素形成的袋状结构中组氨酸可以直接结合血红素中的铁离子(包括Fe2+和Fe3+),这是由于Ngb结构上的特殊性导致的。目前关于Ngb的生物学功能尚未完全清楚,人们推测其功能可能与下面的几个方面有关：①氧气的储存和缺氧时促进氧气向线粒体或者直接介导氧气向线粒体传递：因为Ngb结构非常类似血红蛋白和肌红蛋白,以及它能够结合氧气；②氧感受功能和清除活性氧、N0基团等活性物质：Ngb可能是作为氧感受器,根据氧浓度的变化参与细胞内信号传导通路调节；清除活性氧、NO基团等活性物质：因为其能够结合NO；③调节细胞内的信号通路。④保护线粒体功能：通过抑制GDP从Ga蛋白上分离以及促进Gp Y复合物的释放,从而降低细胞色素c。当前的研究虽然不能完全解析Ngb的功能,但是许多文献的报道,其在动物、原代培养的神经元及细胞系中的神经保护作用是得到支持的,特别是在缺血缺氧时Ngb的神经保护作用。有实验证明在大脑局灶性和半球的缺血的模型下,Ngb转基因小鼠的缺血体积比正常老鼠的要小,并且氧化应激相关指标的含量也降低。同样的结果也在大鼠大脑中动脉闭塞模型中得到验证,通过给予表达Ngb的腺病毒载体增加Ngb表达后,其梗塞面积大大减少,相反,通过脑室内注射反义寡脱核苷酸序列减少Ngb的表达,发现梗塞面积增大,以及更严重的神经功能损害。此外,在体外实验部分,在培养的神经元细胞中,Ngb过表达的细胞降低缺血复氧损伤的敏感性。再者,越来越多的证据表明Ngb不仅仅在缺血缺氧脑损伤中有保护作用,在其他一些疾病中也有保护作用。例如,在神经细胞和小鼠阿尔兹海默病模型中均证实,Ngb过度表达降低p-淀粉样蛋白和NMDA的毒性,从而起到保护作用。目前已经有实验证明Ngb在脑缺血及外伤性脑损伤后参与了调控并起一个保护作用。但是据我们所知,目前关于Ngb在SAH后脑组织的表达尚未有报道,基于此,我们设计了本项课题,通过建立大鼠SAH模型来研究Ngb的表达,并探讨其潜在的作用机制。目的：本实验中采用视交叉前池注血法建立大鼠SAH模型,应用Western blot analysis、实时定量逆转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)分别检测颞叶皮质Ngb蛋白水平及mRNA水平的变化,免疫组化法及免疫荧光双染法观察SAH后脑组织中Ngb的表达及细胞定位,总结Ngb在SAH后的不同时间含量变化及部位变化的规律,并探讨Ngb在SAH后表达变化的意义及其潜在的作用机制。方法：1实验动物和分组取健康成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠84只,体重280～320g,由南京军区南京总医院比较医学科提供。按随机数字表法将实验大鼠分为空白对照组12只和SAH组72只。SAH组根据动物模型建立后3、6、12、24、48、72小时6个时间点分为6个亚组,每个亚组12只大鼠,其中6只大鼠脑组织进行新鲜组织制备,用于Western blot analysis及实时定量PCR检测,6只甲醛固定用于免疫组化染色及免疫荧光双染。2大鼠SAH模型的建立采用视交叉前池注血法建立SAH模型。采用4%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射将大鼠麻醉后,取俯卧位,利用立体定向仪将大鼠头部固定,并保持颅顶水平位。备皮及常规消毒后,沿颅顶正中矢状线切开皮肤、肌肉及骨膜,于前囟前7.5mm正中线上的位置处,牙科钻头颅骨钻孔。取一根圆头并带有侧孔的导管,与水平面成30度角,将导管沿正中线刺入,在距离颅底约2-3mm的地方停止,骨蜡封闭骨孔与导管之间缝隙以防止脑脊液露出。再将大鼠改为仰卧位,然后显微镜下解剖暴露右股动脉,抽取自体动脉血0.3ml,经导管缓慢注入蛛网膜下腔。拔出导管,立即用骨蜡封闭骨孔,缝合头皮。置30度头低位约1小时后放入笼内饲养。空白对照组不做任何处理。3动物处死和取材在相应的时间点将大鼠用4%的水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后,对照组及SAH组每一亚组各取6只大鼠,经心脏灌注等渗盐水至肝脏发白后,开颅取脑。将脑组织-80℃液氮保存,用于Western blot及实时定量PCR检测。其余6只大鼠经心脏灌注等渗盐水后,再用250ml4%多聚甲醛灌注,取脑,置于4%多聚甲醛中固定24h,用于免疫组化染色及免疫荧光双染。4Western blot analysis在冰台上分离颞叶脑组织,脑组织总蛋白的提取采用组织裂解法,提取的组织总蛋白定量后行Western blot检测。将取得的颞叶组织分别加入2OmM Tris(包含0.2%SDS,1%Triton X100,1%deoxycholate,1mM phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF))和0.11IU/ml的抑肽酶。匀浆后在4℃、12000g的条件下离心20min。取上清液进行蛋白定量,并加入凝胶电泳上样缓冲液,在95℃下水浴5分钟。采用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质(90V)。分离后的蛋白按常规转膜方法转印到聚偏二氟乙烯膜上(100V,90分钟),5%的脱脂奶粉室温下封闭2h,分别加入兔抗大鼠Ngb多克隆抗体(1：100,美国Santa Cruz公司)和兔抗大鼠p-actin多克隆抗体(1：3000,美国Bioworld公司)4℃过夜。Tris盐酸缓冲液洗膜后分别加入山羊抗兔IgG-HRP(1：5000,美国Bioworld公司),室温下孵育2h,以增强化学发光法显色阳性条带,结果采用UN-SCAN-IT图像分析软件测量显色阳性区的平均灰度值,用Ngb灰度值/β-actin灰度值表示Ngb相对表达水平,并统计分析。5RNA的提取和实时定量PCR在冰台上分离颞叶的脑组织,脑组织总的RNA提取按照TRIZOL(TaKaRa公司,大连)试剂盒的说明书进行。用分光光度法测定260/280吸光度值。1%琼脂糖凝胶电泳检测总的RNA的纯度。采用PrimiescriptTM RT试剂盒(TaKaRa公司,大连)将RNA逆转录为cDNA。实时定量PCR反应混合物采用20μl体系,包含10μl的SYBRPremix Ex Taq试剂,各0.4μl的正反引物(10μ mo1),2μl的cDNA及7.2μl无核酸酶的水。扩增的条件为：95℃预变性30min；95℃5s变性；65℃30s退火；75℃30s延伸,总共进行40个循环。实验每个样本分一主孔两副孔,以CT值为衡量指标,每个目标基因与p-actin的比值得出不同时间点各目标基因的相对表达量,公式为R=2[ΔCT target (Normal-SAN)-ΔCTβ-actin (Norml-SAH)],并行统计学分析。6免疫组化染色将放置在4%多聚甲醛的脑组织常规石蜡包埋,并进行连续切片,切片厚度为4μm。常规石蜡切片脱蜡,水化,抗原修复后,5%BSA室温下封闭30min后加入兔抗大鼠Ngb多克隆抗体(1：50)4℃孵育过夜。PBS洗15min×3次后用含1.6%H202的PBS封闭10分钟。然后加入HRP标记的二抗室温孵育1h。加DAB显色应用液染色10min,自来水冲洗,苏木精复染,脱水,透明,封片。7免疫荧光双染将4%多聚甲醛浸泡的脑组织分别用20%及30%的蔗糖溶液脱水。OCT胶包埋后连续切片,厚度为4分μm。冰冻切片在室温下复温30分钟,Triton x-100室温下孵育1小时,随后用胎牛血清封闭1小时。封闭后用兔抗大鼠Ngb抗体(1：50)和小鼠抗大鼠NeuN抗体(1：200)；兔抗大鼠Ngb抗体(1：50)和小鼠抗大鼠GFAP抗体(1：200)；兔抗大鼠Ngb抗体(1：50)和小鼠抗大鼠Iba1抗体(1：500)分别加入到切片4℃过夜孵育。PBA洗脱后用Alexa Flour594山羊抗兔二抗和Alexa Flour488山羊抗小鼠二抗室温下孵育2小时。最后加入DAPI对细胞核进行染色2分钟,PBS洗脱后,荧光显微镜观察并拍照。一抗洗脱后的所有步骤都在避光下进行。8统计学分析采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析,所有定量数据均以均数±标准误(x±SEM)表示,多组均数比较采用单因素方差分析,差异具有统计学意义时进行SAH后各组与对照组间比较,采用Dunnett-t检验,均以P<0.05为有统计学意义。结果：1动物实验数量分析84只大鼠进行实验,l0只大鼠动物模型制备失败,3只大鼠术后死亡,均予以剔除并随机补充,最终纳入分析仍为84只。2SAH后Ngb蛋白水平升高Ngb蛋白条带出现在约17kDa的位置上,并呈动态变化。在对照组中,Ngb的蛋白表达量相对较低。SAH后,Ngb蛋白水平在3h时已经开始升高,并在24h时达到高峰,随后逐渐下降,至SAH后72h仍高于正常水平。与对照组相比,SAH后24h Ngb蛋白表达水平差异具有显著性意义(P<0.05),其余各亚组与对照组相比差异无统计学意义。3SAH后Ngb的mRNA水平提高Ngb的mRNA含量在SAH后成动态变化,在对照组中,Ngb的含量相对较低,在SAH后的各亚组中,Ngb的mRNA水平从SAH后3h开始升高,6h达到高峰,峰值约达对照组的3倍,随后开始逐渐下降。统计学分析结果显示SAH后6h及12h组分别与对照组相比具有统计学差异(p均小于0.01)。4免疫组化染色分析Ngb表达Ngb免疫反应强阳性细胞呈深棕黄色,弱阳性成浅棕黄色。取SAH后24h组与对照组切片的颞叶皮质进行对比观察。对照组中Ngb免疫反应阳性细胞相对较少,且阳性反应较弱,而SAH后24h相同的区域内胞浆Ngb阳性细胞数量均有不同程度的增多,染色亦较强,呈强阳性。除颞叶皮质外,海马、小脑及脑干均可发现Ngb免疫阳性细胞。切片中可发现典型的Ngb反应阳性的神经元,并可观察到阳性染色主要分布在胞浆。统计学分析发现SAH后24h组的Ngb免疫阳性细胞率为80.5%,对照组为55.3%,差异具有统计学意义。5免疫荧光染色分析Ngb表达及分布取SAH后24h组与对照组切片对比,结果显示两组切片内均可见Ngb阳性细胞。相比之下,对照组荧光表达强度较弱,阳性细胞较少,而在SAH后24h组中,荧光强度增强,Ngb阳性细胞数增多。实验中发现Ngb阳性染色主要在NeuN阳性细胞的胞浆,从得到的照片中统计,大约有98.9%Ngb阳性细胞同时也是NeuN阳性的细胞。进一步观察可发现Ibal阳性细胞也有同时Ngb染色阳性的,有趣的是,并未发现有Ngb和GFAP同时阳性的细胞。结论：1.本实验利用视交叉池注血法模型模拟大鼠蛛网膜下腔出血,发现大鼠SAH后Ngb蛋白及基因在颞叶皮质中的表达存在一定的时间-含量的变化规律,并且观察到Ngb表达的细胞类型及细胞内的表达位置。2.Ngb在正常脑组织中含量相对较少,在SAH后存在一个时间-表达量的关系。在SAH后早期(3小时)及出现Ngb表达量的升高的趋势,24小时时达到最高值,随后逐渐下降,至72小时仍高于正常水平。3.Ngb的mRNA水平在正常脑组织中的含量较少,但在SAH后3小时即迅速升高,6小时即达高峰,随后呈下降趋势,至72小时降至正常水平附近。4.Ngb主要在大脑皮质表达,在海马及小脑中亦有表达。同时发现,Ngb在神经元和小胶质细胞的胞浆中表达,在星胶中并没发现有表达。5.本实验证实了Ngb在大鼠神经元胞浆中表达,同时发现其在小胶质细胞中亦有发现,在大鼠SAH后其表达量增加,具有时间-表达量关系。结合先前研究结果,我们推测Ngb在SAH中也发挥重要的作用,扮演神经保护的角色。