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目的:脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重的致残性中枢神经系统疾病。由于神经元的不可再生性导致患者会出现不同程度的运动、感觉以及括约肌功能障碍等症状。脊髓损伤常导致患者生活质量明显下降并且高额的医疗费用给患者家庭带来了巨大的经济负担。脊髓损伤通常包括两个病理过程即原发性脊髓损伤和继发性脊髓损伤。原发性损伤是指由直接或间接外力瞬间导致的损伤,继发性损伤是在原发性损伤基础上发生的局部缺血、水肿、氧化应激和炎症等一系列复杂的反应。由于继发性脊髓损伤的这一系列病理过程具有可调控性,这在很大程度上影响患者的预后。因此对继发性脊髓损伤病理过程的调控成为当今脊髓损伤治疗的研究热点之一。自噬(autophagy)是一种广泛存在于真核细胞内的溶酶体依赖性的降解过程。自噬通过双层膜包裹待降解的细胞成分形成自噬泡,自噬泡随后与溶酶体融合成为自噬溶酶体。待降解物质在溶酶体内被各种酶消化和降解,以实现细胞自身的代谢和某些细胞器的更新,这对维持细胞稳态有非常重要作用。研究发现提高脑创伤或脊髓损伤疾病模型中损伤区组织自噬能提高动物预后。例如,自噬能通过抑制大鼠脊髓损伤后细胞凋亡而减少神经损害和提高运动功能恢复。雷帕霉素在小鼠脑创伤模型中提高自噬而发挥着神经保护作用。Netrin-1是Netrins家族的成员之一,Netrin-1因在胚胎发育期中能介导神经元的迁移和轴突的生长,而被人们首次认识。随着对Netrin-1研究的深入,发现Netrin-1在脊椎动物神经系统中仍持续表达。此外,Netrin-1可以与其受体唐氏综合征细胞黏附分子(DSCAM)结合而激活AMPK进而影响神经元轴突的生长。众所周知,AMPK/mTOR信号通路在调控细胞自噬中发挥重要作用,这提示我们Netrin-1是否可以通过AMPK/mTOR信号通路调节脊髓损伤后神经元的自噬而起到神经保护作用?其可能潜在的机制是什么?对此我们设计了如下三部分实验:1、大鼠脊髓损伤后损伤区脊髓组织中自噬表达变化的实验研究。2、Netrin-1对脊髓损伤大鼠神经保护作用及其机制的初步实验研究。3、Netrin-1对脊髓损伤大鼠神经保护作用机制的进一步实验研究。研究方法:第一部分:健康成年雌性SD大鼠(体重220-250g)随机分成两组,假手术组和脊髓损伤组,脊髓损伤组再依据时间点不同分为5个亚组:4h、1d、3d、7d、14d组。采用改良Allen’s方法建立大鼠脊髓损伤模型,脊髓损伤后4h、1d、3d、7d、14d取材。采用Western blot法检测损伤节段脊髓组织中的自噬标志分子LC3和Beclin-1的表达。损伤后3d,利用免疫荧光双标记法检测自噬标志分子LC3或Beclin-1与神经元的共定位情况。第二部分:大鼠随机分成五组;假手术组、脊髓损伤组、Netrin-1组、Netrin-1+Compound C组和Compound C组。采用改良Allen’s方法建立大鼠脊髓损伤模型。术后3d取材,采用Western blot法检测AMPK/MTOR信号通路相关蛋白p-AMPK、AMPK、p-m TOR、mTOR、p-p70s6k和p70s6k、自噬标志因子LC3和Beclin-1以及凋亡相关蛋白Cleaved-Caspasse3的表达;利用免疫荧光双标记法计数LC3或Beclin-1表达阳性的神经元数目;TUNEL法检测脊髓组织中神经元凋亡的比率。术后21d取材,行HE染色计算各组大鼠脊髓横切片的剩余面积;采用NISSL染色计数各组大鼠脊髓前角存活神经元的数目。利用BBB评分法在术后0d、1d、3d、7d、14d、21d对各组大鼠进行运动功能评分。第三部分:大鼠随机分成四组;假手术组、脊髓损伤组、Netrin-1组、Netrin-1+Compound C组。采用改良Allen’s方法建立大鼠脊髓损伤模型。术后3d取材,采用Western blot法检测AMPK/MTOR信号通路相关蛋白p-AMPK、p-ACC、p-m TOR、p-p70s6k;溶酶体生成相关蛋白LAMP1、CTSD、ATP6V1A;自噬标志因子LC3和自噬底物P62;凋亡相关蛋白Cleaved-Caspasse3、Bax、Bcl-2以及转录因子EB(TFEB)的表达变化。利用免疫荧光双标记法检测并计算发生TFEB核转位神经元的比率、各组神经元LAMP1的荧光密度值、LC3或P62阳性神经元的比率、Cleaved-Caspase3阳性神经元的比率。术后28d取材,采用NISSL染色计数各组大鼠脊髓前角存活神经元的数目。利用BBB评分法在术后0d、1d、3d、7d、14d、21d、28d对各组大鼠进行运动功能评分。结果:第一部分:Western blot法检测结果提示与假手术组相比,脊髓损伤后4h Beclin-1蛋白的表达以及LC3-II/LC3-I的比值均显著升高,并随着时间推移逐渐升高,于脊髓损伤后3d达到峰值。虽然二者在此后表达逐渐降低,但在7d和14d仍高于假手术组。经过免疫荧光双标记法检测,我们发现脊髓损伤后3d时表达LC3或Beclin-1阳性的神经元数目较假手术组显著升高。第二部分:Western blot法检测结果表明大鼠脊髓损伤后损伤区脊髓组织中AMPK/mTOR信号通路激活,这表现在p-AMPK/AMPK比值显著升高同时伴有p-m TOR/mTOR比值和p-p70s6k/p70s6k比值的明显降低;损伤区脊髓组织中自噬标志分子Beclin-1的表达和LC3-II/LC3-I比值显著升高。与脊髓损伤组相比,Netrin-1治疗进一步激活了脊髓组织中AMPK/mTOR信号通路并显著提高了Beclin-1的表达和LC3-II/LC3-I比值。而AMPK选择性抑制剂Compound C能显著抑制Netrin-1引起的AMPK/mTOR信号通路的激活以及明显降低LC3和Beclin-1的表达。与假手术组相比,大鼠损伤脊髓组织前角LC3或Beclin-1表达阳性的神经元数目以及神经元的凋亡比率显著升高,而脊髓横切片的剩余面积和前角存活的神经元的数目显著减。而Netrin-1能明显提高大鼠损伤脊髓组织前角LC3或Beclin-1表达阳性的神经元数目、前角存活的神经元的数目以及脊髓横切片的剩余面积同时可显著降低神经元的凋亡比率。BBB评分结果表明,术后前14d脊髓损伤组大鼠和Netrin-1组大鼠的分数无统计学意义差异。而从术后第14d开始Netrin-1组大鼠的分数显著高于脊髓损伤组大鼠的分数。第三部分:Western blot法检测结果发现,与假手术组相比,脊髓损伤组大鼠损伤区脊髓组织中p-AMPK和p-ACC的表达显著升高同时伴有p-mTOR和p-p70s6k表达的明显降低,这表明AMPK/mTOR信号通路被激活;同时LAMP1、CTSD、ATP6V1A、P62、Cleaved-Caspasse3的表达显著增加、LC3-II/LC3-I和Bax/Bcl-2比值的显著升高以及细胞核内TFEB的表达显著增高。与脊髓损伤组或Netrin-1+Compound C组相比,Netrin-1组大鼠受损脊髓组织中AMPK/mTOR信号通路显著激活和细胞核内TFEB的表达显著增高;同时LAMP1、CTSD、ATP6V1A的表达以及LC3-II/LC3-I比值明显升高,而P62、Cleaved-Caspasse3的表达以及Bax/Bcl-2的比值显著降低。免疫荧光双标记法检测结果显示:大鼠脊髓损伤后损伤区脊髓前角神经元TFEB核转位的比率、神经元LAMP1的荧光密度值以及Cleaved-Caspase3、LC3或P62阳性神经元的比率显著升高。与脊髓损伤组或Netrin-1+Compound C组相比,Netrin-1组损伤区脊髓前角中TFEB核转位阳性神经元的比率、神经元LAMP1的荧光密度值以及LC3阳性神经元的比率显著升高;而p62和Cleaved-Caspase3阳性神经元的比率明显降低。NISSL染色结果表明脊髓损伤后脊髓前角存活神经元的数目显著降低,而Netrin-1能显著提高脊髓损伤后脊髓前角存活神经元的数目,而Netrin-1+Compound C的联合治疗则又明显降低了神经元的数目。BBB评分结果表明,在整个实验过程中脊髓损伤组和Netrin-1+Compound C组大鼠的BBB评分始终无统计学差异。术后前14d脊髓损伤组大鼠和Netrin-1组大鼠的分数无统计学意义差异。而从术后第14d开始,Netrin-1组大鼠的分数开始显著高于脊髓损伤组或Netrin-1+Compound C组大鼠的分数。结论:第一部分:大鼠脊髓损伤后损伤区组织中自噬从术后第4h开始逐渐增强并于3d时达到高峰。第二部分:大鼠脊髓损伤后Netrin-1可能通过激活AMPK/mTOR信号通路而提高损伤区前角神经元自噬,抑制了神经元凋亡,进而发挥着神经保护作用。第三部分:大鼠脊髓损伤后Netrin-1可能激活脊髓前角神经元中AMPK/mTOR信号通路而促进TFEB的核转位,从而提高了溶酶体的生成和自噬泡的生成,进而提高了损伤区神经元内自噬潮,抑制了神经元的凋亡,进而发挥着神经保护作用。