双壳贝类中麻痹性贝类毒素的提取、分离和检测技术研究

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麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP)是一类阻断神经细胞钠离子通道,对人体神经系统产生麻痹作用的海洋生物毒素。该毒素对人体毒性极强,当人们误食染毒的贝类时就可能发生中毒死亡。针对目前PSP监测和研究的需要,本文对双壳贝类中的麻痹性贝类毒素的提取、纯化和色谱检测方法进行了研究。 采用沸水浴加热和超声波提取法,在染毒栉孔扇贝性腺的匀浆液中加入不同浓度的醋酸和盐酸溶液进行PSP提取实验。结果表明,在沸水浴加热条件下,在性腺匀浆液中加入赫酸浓度为0.25—1.0mol/L范围内,随着酸浓度的增大,提取液中易转化组分C1,C2,B1的浓度迅速减小,同时伴随着GTX2/3浓度的迅速上升。而加入醋酸浓度为0.04—1.0mol/L范围内提取液中毒素各组分浓度变化不明显。采用0.2mol/L盐酸和0.3 mol/L醋酸对PSP超声波提取,提取液中PSP浓度相差不大。 运用BIO-GEL P2凝胶柱对染毒贝类粗提液中的PSP进行纯化,并探索荧光分光光度和HPLC检测相结合的洗脱液中PSP定位方法。结果表明,荧光分光光度和HPLC检测相结合,可以有效、快捷定位洗脱液中PSP位置。通过正交试验,确立了C和GTX毒素HPLC分析的柱后衍生条件为pH=9.0、氧化反应温度为65℃、醋酸浓度为1.0M、HIO4浓度为10mM。 本文改进了Oshima提出的麻痹性贝类毒素HPLC分析方法,建立了同时测定贝类中10种麻痹性贝类毒素(PSP)的高效液相色谱法。以庚烷磺酸钠离子对试剂的两种缓冲溶液作为流动相,Inertsil C8-3色谱柱(250×4.6mm,5um)为分析柱,采用梯度改变两种缓冲溶液并在流动相中加入乙腈的洗脱方法,一次进样可同时定性及定量检测GTX1,GTX4,GTX2,GTX3,dcGTX2,dcGTX3,neoSTX,STX,dcSTX,B1(GTX5)10种PSP组分。通过测定标准毒素的系列浓度,确定了毒素各组分工作曲线的回归方程。该方法的灵敏度、准确度和精密度均符合生物毒素检测技术的要求。 在此基础上,本文还提出了一种更为简便的分析麻痹性贝毒GTX组分和NEO/dcSTX/STX组分的方法。本法仅使用了一种缓冲溶液作为流动相,在Inertsil C8-3色谱柱(250×4.6mm,5um)上,采用梯度改变乙腈在流动相中的比例
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