目的：　　研究临床分离的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)的耐药谱及耐药机制，分析其流行传播特点，为及时遏制临床感染的暴发流行和抗菌药物的合理使用提供指导。　　方法：　　1.收集温州医科大学附属第二医院2012年1月-2013年11月间临床连续分离的对碳青霉烯类药物耐药（耐药+中介）的肠杆菌科细菌，分析其临床分布特点及耐药谱，了解该院耐药菌株的耐药形势。　　2.采用改良Hodge试验对碳青霉烯类耐药菌株进行碳青霉烯酶表型确证试验，初步筛查产碳青霉烯酶菌株;采用PCR技术扩增主要β-内酰胺酶基因，包括碳青霉烯酶、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶（AmpC酶），并对阳性扩增产物进行测序和BLAST比对，检测菌株耐药基因的携带情况，研究菌株的耐药机制。　　3.利用碳青霉烯酶基因阳性菌株与受体菌J53和EC600的接合转移试验研究碳青霉烯酶基因及其质粒的水平转移能力，对阳性接合子进行PCR验证碳青霉烯酶基因及其它耐药基因，并检测阳性接合子的体外药敏情况。　　4.通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)与肠杆菌基因组间重复一致性序列(ERIC-PCR)分析我院产碳青霉烯酶菌株间的同源性，研究耐药菌株的流行特征;通过多位点序列分型(MLST)，分析本研究中产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌与全球流行株的相关性。　　5.提取产碳青霉烯酶菌株的质粒，利用普通PCR技术检测碳青霉烯酶基因是否定位于质粒上并分析其基因所在质粒的大小。　　结果：　　1.本研究共收集到温州医科大学附属第二医院2012年1月-2013年11月临床连续分离的非重复碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌57株，其中肺炎克雷伯菌25株，阴沟肠杆菌16株，产气肠杆菌10株，产酸克雷伯菌2株，粘质沙雷菌2株，摩根摩根菌1株，弗氏柠檬酸杆菌1株。菌株标本来源以痰液为主，占63.2％，其次是血液(10.5％)、创口脓液(10.5％)、尿液(8.8％)和其它(7.O％)。菌株的科室来源较广泛，但仍存在一定的聚集性，18株(31.6％)来源于ICU病房，14株(24.6％)来源于神经外科病区。临床抗菌药物体外敏感性试验显示，57株肠杆菌科细菌对碳青霉烯类有不同程度的耐药，对亚胺培南和厄他培南的敏感率分别为21.1％和3.5％，同时对头孢菌素类、单环内酰胺类、β-内酰胺酶抑制剂复合物和呋喃妥因等抗菌药物均表现出较高的耐药性，敏感率基本都在20％以下，甚至全耐药，但对氨基糖苷类（丁胺卡那、庆大霉素和妥布霉素）和氟喹诺酮类（左氧氟沙星）药物的敏感性较好，尤其是丁胺卡那，敏感率高达96.5％。　　2.57株碳青霉烯类耐药菌株中，改良Hodge试验阳性的有37株(阳性率64.9％)，阴性20株;PCR检测碳青霉烯酶基因阳性的37株（阳性率64.9％），阴性20株。以PCR扩增结果为参照标准，改良Hodge试验的灵敏度为97.3％，特异度为95％。57株肠杆菌科细菌耐药基因测序结果显示，27株携带KPC-2，6株携带NDM-1，3株携带IMP-4，1株携带IMP-8;42株携带ESBLs基因，阳性率73.7％;16株携带AmpC酶基因，阳性率28.1％;大多菌株都同时携带多种耐药基因，同时携带碳青霉烯酶基因及其它耐药基因的占50.9％。　　3.接合转移试验:27株产KPC-2菌株中，有24株获得阳性接合子，3株未接合成功;4株产IMP菌株中有2株IMP-4和1株IMP-8接合成功，1株IMP-4未接合成功;6株产NDM-1的菌株全部接合成功。阳性接合子对β-内酰胺类药物的耐药性很高，但对氨基糖苷类、氟喹诺酮类、复方新诺明和呋喃妥因几乎全部敏感。　　4.脉冲场凝胶电泳发现，10株产碳青霉烯酶的阴沟肠杆菌具有较高的同源性，存在五个不同的克隆型，其中主要克隆型A型有5株，均携带KPC-2，B型2株，均携带NDM-1，C、D、E型各1株，分别携带KPC-2、IMP-8和NDM-1。ERIC-PCR结果显示，7株产气肠杆菌具有很高的同源性，存在两个不同克隆型，其中A型4株，B型3株，这7株菌均携带KPC-2碳青霉烯酶基因。同一克隆型菌株携带的耐药基因相同（EA10除外），耐药谱也基本相同，且来自同一病区。多位点序列分型显示，17株碳青霉烯酶阳性的肺炎克雷伯菌中主要存在9个ST型，其中以ST11型为主，有6株，其次为ST13型4株，ST15、ST231、ST147、ST1、ST185和ST45各一株，另外，还发现一株新的ST型，提交肺炎克雷伯菌MLST数据库，命名为ST1726。　　5.经质粒PCR扩增结果显示，所有碳青霉烯酶基因均存在于质粒上，其中KPC-2均位于54 kb左右的质粒，IMP-4、IMP-8和NDM-1位于更大的约100 kb左右的质粒上。　　结论：　　1.碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)耐药形势非常严峻，多表现为多重耐药，甚至对替加环素的敏感性也很差，但对氨基糖苷类和氟喹诺酮类药物的敏感性较好，可替代β-内酰胺类作为临床感染的首选治疗药物。另外CRE菌株的科室来源具有一定的聚集性，提示临床需加强这些病区的院感监测和防控。　　2.我院CRE菌株的耐药机制主要是产碳青霉烯酶，除了国内外广泛流行的KPC-2、IMP外，还检测到了国内少有报道的NDM-1金属酶，且此种酶在多种肠杆菌科细菌中均有检出;耐药菌株大多同时携带多种耐药基因，是导致菌株多重耐药一个重要原因。本研究还证实了改良Hodge试验对于快速筛查产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌具有很高的灵敏度和特异度。　　3.大部分菌株可通过接合转移试验将碳青霉烯酶基因传递给受体菌大肠埃希菌，说明耐药基因存在于可移动质粒上，可通过水平传播的方式引起耐药菌株的流行播散。　　4.本研究中的CRE菌株具有很高的同源性，并且同一克隆型的菌株几乎都来自同一病区，提示耐药菌株存在克隆传播，应加强病区医护人员卫生、消毒管理。我院产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌以ST11型为主，这也是国内的主要流行株，与国外的主要流行株ST258仅存在一个等位基因的差异。