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研究背景牙周病是牙列缺失、牙列缺损的主要病因之一,而吸烟是牙周病发生的重要致病因素。目前,吸烟人群牙周病发生的分子机制尚不清楚。本研究以烟草中最重要的致病因素之-尼古丁为研究对象,采用细胞术的方法,对尼古丁的细胞毒性和作用机制进行了研究,为牙周病的预防提供理论依据。研究目的1、确证尼古丁对人PDLFs的细胞毒性；2、探讨尼古丁对PDLFs的细胞毒性机制,以进一步明确相关信号转导通路所起的作用,为牙周病的预防和治疗奠定分子研究基础。研究方法培养人PDLFs细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)和流式细胞术(Flow cytometry, FCM)观察不同浓度的尼古丁对PDLFs的细胞生长增殖抑制情况,对细胞周期的影响情况,以及分析细胞凋亡率的变化,从而分析尼古丁对PDLFs的毒性作用。逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测尼古丁干预PDLFs细胞24h后,相关凋亡蛋白PI3K、AKT、Bcl-2和Bax的mRNA水平；激光共聚焦显微镜测定细胞内Ca2+荧光强度；Western Blotting免疫印迹法检测尼古丁作用PDLFs后,凋亡执行蛋白Caspase-3的蛋白表达水平。根据RT-PCR、Western Blotting和激光共聚焦显微镜测定的实验结果,分析尼古丁对牙周的细胞毒性作用中的信号转导机制。研究结果1、尼古丁对人PDLFs的细胞毒性不同浓度的尼古丁(10000μg/ml、1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μ∥m1、0.1μg/ml和0.01μg/ml)作用于PDLFs细胞24 h、48 h和72h后,均能抑制PDLFs细胞的生长。随着尼古丁浓度的增加,A490值逐渐减小；并且时间越长,A490值也逐渐减小。尼古丁作用PDLFs细胞48h后,G0G1期比例逐渐增高,而S期和G2期的比例则呈下降趋势(P<0.05)。AnnexinV-FITC/PI双标记结合流式细胞仪分析显示：尼古丁实验组分别作用于PDLFs细胞作用48h后,各实验组细胞均出现凋亡,根据凋亡率排序为：1000μg/ml尼古丁实验组>10μg/ml尼古丁实验组>0.1μg∥ml尼古丁实验组。说明尼古丁对PDLFs细胞有增殖抑制作用、细胞周期阻遏作用和促凋亡作用。2、尼古丁对PDLFs细胞线粒体信号通路的影响尼古丁作用于PDLFs细胞24h后,细胞内Ca2+荧光强度显著增加,且随着尼古丁剂量的增加,细胞内Ca2+荧光强度值随之增高(r=0.747、F=41.333、P=0.000)；Bcl-2的mRNA表达水平与正常对照组比较显著下调,而Bax的表达水平上调,且随着剂量的增加细胞内Bc1-2转录随之降低(r=0.851、F=80.014、P=0.000),而Bax转录随之增高(r=0.961、F=341.270、P=0.000)；Caspase3基因转录增加,且随着尼古丁剂量的增加,Caspase3的基因转录呈逐渐增高趋势(r=0.935、F=318.371、P=0.000)。同时,Caspase3蛋白表达增加,且随着尼古丁剂量的增加,Caspase3蛋白的翻译水平表达呈逐渐增高趋势(r=0.677、F=8.459、P=0.016)。说明尼古丁可引起PDLFs细胞外Ca2+内流,胞内[Ca2+]增加,Bcl-2基因表达显著减低而Bax的表达水平上调,引起Cyt C释放,PDLFs细胞凋亡发生3、PI3K/Akt信号通路在尼古丁致PDLFs凋亡中的保护作用不同浓度的尼古丁作用于PDLFs细胞24h后,PI3K的表达水平上调,且随着剂量的增加,PI3K的基因表达水平呈逐渐增高趋势(r=0.675、F=8.379、P=0.016)；Akt的表达水平下调,且随着尼古丁剂量的增加,Akt的基因表达水平呈逐渐降低趋势(r=0.989、F=442.819、P=0.000)；Akt在各实验组Thr308、Ser473位点磷酸化磷酸化显著高于对照组(P<0.01)；Caspase3基因转录增加,且随着尼古丁剂量的增加,Caspase3的基因转录呈逐渐增高趋势(r=0.935、F=318.371、P=0.000)。同时,Caspase3蛋白表达增加,且随着尼古丁剂量的增加,Caspase3蛋白的翻译水平表达呈逐渐增高趋势(r=0.677、F=8.459、P=0.016)。说明PI3K/Akt参与了尼古丁诱导的PDLFs细胞凋亡的过程,并且发挥了抑制凋亡发生的作用,但是尼古丁诱导的PDLFs细胞凋亡的促进因素的作用效果强于PI3K/Akt信号通路的作用,而使Caspase3表达增加,发生了凋亡事件。研究结论1、尼古丁对PDLFs细胞具有细胞毒性,主要表现为的生长增殖抑制、细胞周期阻滞于G0G1期和促凋亡作用。2、尼古丁诱导人PDLFs细胞凋亡的发生机制是共同激活了尼古丁的促凋亡的线粒体信号转导通路和抑制凋亡的PI3K/Akt信号转导通路,其结果是共同导致了凋亡执行蛋白Caspase3的表达增加而发生了PDLFs细胞凋亡事件。