第一部分：G-CSF诱导移植物抗白血病效应治疗异基因造血干细胞移植后复发白血病的临床研究[目的]评价粒细胞集落刺激因子(G-CSF)单独或联合小剂量阿糖胞苷(Ld Ara-C)方案治疗异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)后复发白血病的有效性与安全性,并探讨其可能的作用机制。[方法]一、回顾性分析暨南大学附属第一医院血液科2008年之前G-CSF单药治疗2例Allo-HSCT后复发白血病(简称“移植后复发白血病”)患者的病例资料；二、2008年1月开始进行“G-CSF联合Ld Ara-C方案治疗移植后复发白血病”的前瞻性临床研究,至今已连续纳入16例患者。18例患者中男11例,女7例,中位年龄31.5(17～56)岁；急性淋巴细胞白血病(ALL)10例,急性髓细胞白血病(AML)4例,急性混合细胞白血病(MAL)1例,慢性髓细胞性白血病(CML)3例；15例急性白血病(AL)均为血液学复发,3例CML中2例急变期复发,1例细胞遗传学复发；2例接受G-CSF 150μg/d单药治疗；另16例接受G-CSF 150-300μg/d联合Ara-C30～50 mg/d治疗,治疗过程中WBC>30×109/L时G-CSF减量使用,出现Ⅱ度及以上急性移植物抗宿主病(aGVHD)或广泛型慢性移植物抗宿主病(cGVHD)时停用G-CSF;骨髓原始细胞减少至<5%时停用Ld Ara-C。血液和骨髓原始细胞不断增加或未减少则退出治疗。完全缓解(CR)后G-CSF减低剂量治疗,根据WBC计数调节用量。[结果]1.总有效率：18例中14例治疗有效(77.8%),中位反应时间为18.5(12～95)天。18例中11例获得CR(61.1%),其中2例CML急变达到完全细胞遗传学缓解(CCyR),中位CR时间为16(12～54)天。长期无病生存率为11.1%。2. G-CSF单药治疗2例,1例AML获得CR,1例ALL无效；G-CSF联合LD Ara-C方案治疗的16例中,13例(81.3%)有效,中位反应时间为18.5(12～95)天。10例(62.5%)获得CR,中位CR时间为16.5(12～54)天。3.可评价的16例中ANC比值(治疗后ANC峰值/治疗前ANC)≥2和<2者分别有12例和4例,治疗有效率分别为100%和25%,差异有显著统计学意义(P<0.01)。4.12例(66.7%)发生G-CSF诱导的GVHD (GI-GVHD),中位出现时间为30.5(5～56)天,其中aGVHD8例,cGVHD4例；GI-GVHD组和无GI-GVHD组的治疗有效率分别为100%(12/12)和33.3%(2/6)(P=0.005),两组CR率分别为83.3%(10/12)和16.7%(1/6) (P=0.013). G-CSF治疗起始于+100d内和+100d后的GI-GVHD分别有5例和7例,两组□～□度aGVHD分别为100%(5/5)和14.3%(1/7)(P=0.015),肠道aGVHD分别为100%(5/5)和14.3%(1/7) (P=0.015), GVHD相关死亡率分别为80%(4/5)和0%(0/7)(P=0.010)。5.18例中位随访161(19～565)天,2例分别无病存活565天和426天(11.1%)；2例因接受其他治疗分别于随访第161和179天退出观察；14例死亡,9例为白血病死亡,4例为重度aGVHD死亡,1例死于肉芽肿性肺炎。合并EMR者和未合并EMR者的白血病死亡率分别为100%和30.8%(P=0.029)。[结论]本研究提示1.G-CSF通过诱导移植物抗白血病(GVL)效应而发挥其抗白血病活性；2. G-CSF与小剂量Ara-C联合,通过其显著协同作用,能有效治疗异基因造血干细胞移植后复发白血病；3.ANC比值≥2和出现GI-GVHD往往预示治疗有效；4. G-CSF方案最常见和严重的毒副作用是GI-GVHD,其为主要死亡原因之一；5. G-CSF起始于+100d内与严重GI-aGVHD发生相关。因此,G-CSF与小剂量Ara-C联合治疗移植后复发白血病,就其CR率而言,具有可与供者淋巴细胞输注(DLI)相比拟的疗效,因此,可考虑作为DLI之外的另一种治疗选择。虽然G-CSF联合小剂量Ara-C获得较高CR率(62.5%),但为之付出的GVHD相关死亡率太高,因此,在治疗策略上需要进一步改进。第二部分小鼠异基因骨髓移植后G-CSF对GVHD和GVL效应影响的实验研究[目的]建立非致死性移植物抗宿主病(GVHD)的小鼠异基因骨髓移植(Allo-BMT)模型和移植后WEHI-3粒单核细胞白血病模型,探讨移植后粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对GVHD和移植物抗白血病(GVL)效应的影响及其可能机制,为G-CSF治疗移植后复发白血病提供实验依据。[方法]1.以雄性C57BL/6(H-2b)小鼠为供鼠、接受8Gy全身照射(TBI)预处理的雌性BALB/c (H-2d)小鼠为受鼠进行Allo-BMT,移植物中除1×107骨髓细胞(BMC)外还加入不同剂量(0、2×106、5×106、1×107)脾细胞(SpC),建立伴发不同程度GVHD的小鼠Allo-BMT模型。根据临床表现、生存时间以及组织病理学检查判断GVHD严重程度。流式细胞术(FCM)检测+30d存活小鼠嵌合率验证移植成功。2.通过与移植物(1×107BMC+2.5×106SpC)同时输入1×106 WEHI-3细胞建立Allo-BMT后粒单核细胞白血病模型,根据临床表现、WBC计数、血涂片检查、解剖大体观察、骨髓和肝脾组织印片检查等判断白血病成模。3. G-CSF对GVHD影响的研究中,受鼠随机分为6组：Syn-BMT对照组(Cs, n=10), Syn-BMT后G-CSF给药组(Gs,n=10),单纯Allo-BMT对照组(CM,n=10),单纯Allo-BMT后G-CSF给药组(GM,n=10), Allo-BMT(移植1×107BMC+5×106 SpC)对照组(CA,n=22), Allo-BMT后G-CSF给药组(GA,n=22)。对照组和G-CSF给药组+1d开始分别皮下注射生理盐水0.1ml/d和G-CSF2μg/d。+10d从CA和GA组各取7只小鼠检测：脾总有核细胞计数(TNC)和FCM检测脾细胞免疫表型(n=5), ELISA法检测血清IL-2、IL-4. IFN-y和TNF-a水平(n=7)。4. G-CSF对GVL效应影响的研究中,BALB/c小鼠随机分为6组：白血病对照组(C1,n=9)和G-CSF治疗组(G1，n=9), Syn-BMT后白血病对照组(C2,n=9)和G-CSF治疗组(G2,n=9), Allo-BMT后白血病对照组(C3,n=10)和G-CSF治疗组(G3,n=10)。对照组和治疗组+1d开始分别皮下注射生理盐水0.1ml/d和G-CSF 2μg/d.濒死小鼠血涂片判断白血病发病,比较各组生存时间。[结果]1.单纯TBI组小鼠照射后9-15d造血衰竭死亡,平均存活12.0±1.9d；同基因移植组小鼠观察至+60d无GVHD临床表现；单纯异基因骨髓移植、异基因骨髓+低剂量(2×106)脾细胞移植、异基因骨髓+中剂量(5×106)脾细胞移植和异基因骨髓+高剂量(1×107)脾细胞移植组的GVHD死亡率分别为9.1%、72.7%、100%和100%；平均生存时间分别为57.3±6.6d、46.9±9.5d、34.5±6.0d和16.6±4.1d,组间差异均有统计学意义(P<0.05)；2只+30d存活的异基因移植受鼠骨髓H2-Kb+细胞%分别为99.8%和99.4%。2.移植同时接种1×106个WEHI-3细胞,Allo-BMT和Syn-BMT后白血病发病率和死亡率均为100%,但Allo-BMT后白血病组较Syn-BMT后白血病组平均存活时间延长(25.0±1.8dvs.17.1±1.2d,P=0.000),表明Allo-BMT存在GVL作用。3. Syn-BMT和单纯Allo-BMT后给予G-CSF对小鼠生存时间无影响。Allo-BMT后G-CSF给药组(GA)较对照组(CA)小鼠GVHD出现早且重、生存时间短(GAvs.CA：19.8±6.1d vs.34.8±4.5d,P<0.05),+10d脾脏TNC增多(7.57±1.44×107vs.4.88±1.19×107,P<0.05),H2-Kb+细胞%均>99%,NK细胞显著扩增(26.54%±2.60%vs.10.12%±2.05%,P<0.01),树突状细胞(DC)数量无明显变化(P>0.05),但DC1亚群减少(31.92%±2.79%vs.41.8%±5.89%,P<0.01),DC2亚群增多(68.08%±2.79%vs.58.2%±5.89%,P<0.01),DC1/DC2比值减低(0.47±0.06 vs.0.73±0.17,P<0.05),DC表面共刺激分子CD80表达轻度增加(47.38%±6.41%vs.40.52%±5.80%,P<0.05),而CD86表达轻度降低(67.82%±0.96%vs.71.68%±2.54%,P<0.05)。4.单纯荷白血病和Syn-BMT后白血病小鼠给予G-CSF治疗不能延长生存时间。Allo-BMT后白血病小鼠给予G-CSF治疗,生存时间延长(31.4±3.9 vs.25.0±1.8,P=0.000),+30d存活数率提高(50% vs.0%,P=0.000)。[结论]小鼠Allo-BMT后使用G-CSF能诱导GVHD和GVL效应,可能与供者NK细胞扩增有关。这为临床移植后G-CSF的应用策略提供了理论基础：1. G-CSF能诱导GVL效应治疗移植后复发白血病；2. G-CSF用于移植后白血病复发的预防；3.移植后早期使用G-CSF有触发或加重GVHD的风险。