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背景解毒通络法治疗急性脑缺血损伤基于中风病毒损脑络病因病机理论。MARCKS (myristoylated alanine-rich C kinase substrate)是PKC (Protein kinase C)特异性底物蛋白,既往研究发现解毒通络中药可显著降低急性脑缺血大鼠脑组织PKC/MARCKS信号通路的活性,提示毒损脑络现代生物学内涵与细胞信号转导有一定的相关性。最新研究表明,Rho/Rho激酶(Rho/ROK)信号通路也参与了MARCKS磷酸化的调节。国外细胞实验显示,ROK选择性抑制剂法舒地尔(Fasudil)通过抑制ROKα不仅降低了MARCKS的活性,还使PKCδ活性下调,因此推断ROK通路可能位于PKCδ/MARCKS通路上游,两者具有交互作用。是否在急性脑缺血时也存在ROKα通路与PKCδ/MARCKS通路的交互作用,共同参与了脑缺血损伤,解毒通络中药苦碟子注射液是否在急性脑缺血时通过下调ROKα、PKCδ/MARCKS的活性起到脑保护作用,尚待研究阐明。目的本课题通过建立大鼠脑缺血损伤模型,证实ROKα与PKCδ/MARCKS信号转导通路可能具有交互作用,且ROKα可能位于PKCδ/MARCKS通路的上游,共同介导了脑缺血损伤。阐明具有解毒通络作用的中药苦碟子注射液通过下调ROKα/PKCδ/MARCKS的活性起到脑保护作用,证实ROKα/PKCδ/MARCKS信号通路及其传递的异常信息与内毒、病络可能具有相关性,从细胞信号转导及其交互作用探讨急性脑缺血毒损脑络生物学基础,为解毒通络法神经保护作用提供实验依据。方法1.制备改良Zea Longa线栓法大脑中动脉闭塞(MCAO)局灶性脑缺血大鼠模型,应用苦碟子注射液、Fasudil进行干预；2.采用Zea Longa五级评分法对模型大鼠进行神经功能损伤评分,观察造模后大鼠评分改变及药物干预后的变化；3.HE染色光镜下观察模型大鼠脑组织形态学的改变及药物干预后的变化；4.应用固定化蛋白印迹法(Western Blot)与免疫组织化学法检测ROKα、PKCδ、p-PKCδ、MARCKS、p-MARCKS在各组大鼠皮层、海马的表达及分布以及药物干预后的改变；5.应用实时荧光定量PCR (Real-time quantitive PCR)检测ROKα、PKCδ、MARCKS mRNA在各组大鼠皮层、海马的表达以及药物干预后的改变；6.应用SPSS10.0统计软件分析大鼠脑组织ROKα、PKCδ/MARCKS的表达及活性与神经功能损伤评分的相关性。结果1.局灶性脑缺血模型大鼠均发生程度不等的神经功能损伤症状,应用苦碟子注射液、Fasudil进行干预后,其神经功能损伤评分显著下降(P<0.01)；2.造模后大鼠光镜下海马、皮层的形态学发生了明显的缺血改变,而应用苦碟子注射液、Fasudil进行干预后可减轻这种改变；3. ROKα、PKCδ、p-PKCδ、MARCKS、p-MARCKS在模型大鼠皮层、海马的表达相比正常组比明显升高(P<0.05)；4.应用苦碟子注射液和Fasudil干预后,ROKα、PKCδ、p-PKCδ、MARCKS、p-MARCKS在大鼠皮层、海马的表达相比模型组均明显降低(P<0.05)；5. ROKα、PKCδ、MARCKS的mRNA在模型大鼠皮层、海马的表达相比正常组比明显升高(P<0.05)；6.应用苦碟子注射液和Fasudil干预后,ROKα、PKCδ、MARCKS mRNA在大鼠皮层、海马的表达相比模型组均明显降低(P<0.05)；7. ROKα、PKCδ、p-PKC8、MARCKS、p-MARCKS在局灶性脑缺血模型大鼠脑组织中的表达水平与神经功能损伤评分呈正相关(P<0.01,P<0.05)。结论1.应用解毒通络中药苦碟子注射液、Fasudil干预局灶性脑缺血模型大鼠,可降低其神经功能损伤评分,减轻脑组织缺血形态学改变,且中药组对神经损伤的改善作用强于西药组,说明苦碟子注射液、Fasudil具有一定的脑保护作用,且苦碟子注射液的脑保护作用优于Fasudil;2. ROKα、PKCδ、p-PKCδ、MARCKS、p-MARCKS及其mRNA在局灶性脑缺血模型大鼠脑组织中表达异常增高,其表达水平与神经功能损伤评分呈正相关,说明ROKα、PKCδ/MARCKS通路的激活与脑缺血损伤有关,且ROKa、PKCδ/MARCKS通路的活性与急性脑缺血后神经元的损害程度密切相关；3.应用ROK选择性抑制剂Fasudil干预局灶性脑缺血模型大鼠,可降低PKCδ/MARCKS通路的表达及活性,推断ROKa与PKCδ/MARCKS通路可能具有交互作用,且ROKa可能位于PKCδ上游,共同参与了脑缺血损伤；4.应用解毒通络中药苦碟子注射液干预局灶性脑缺血模型大鼠,可降低ROKα/PKCδ/MARCKS通路的表达及活性,推断ROKα/PKCδ/MARCKS通路及其传递的异常信息与内毒、病络可能具有相关性,从细胞信号转导机制探讨急性脑缺血毒损脑络生物学基础,为解毒通络法神经保护作用机制提供依据。