桔霉素（Cintrinin,CIT）又名桔青霉素，是由青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）和红曲霉属（Monascus）中某些菌种产生的一种次级代谢产物。桔霉素污染会广泛地存在于谷类农产品、动物饲料及红曲制品。作为一种真菌毒素，桔霉素不仅具有抗细菌、真菌及原生动物活性，同时其被普遍认为对动物存在严重的肾毒性；此外，相关的动物实验也表明其具有潜在的基因毒性、致肿瘤性、致癌性、胚胎毒性及致畸性等。由于桔霉素对人类健康带来的负面影响及其污染的普遍程度，世界已有多个食品安全机构对其作出限量规定。　　目前，桔霉素的定量检测方法主要包括：薄层层析法、高效液相色谱法、生物传感器法及免疫学分析方法等。其中免疫学分析方法是基于抗原抗体之间特异性反应而实现对目的分子进行定量检测，具有灵敏度高、特异性好、前处理简单等优势。然而，免疫学分析方法较其它方法存在较大的基质干扰，一定程度上会影响到检测结果的可靠性。提高免疫学分析方法的灵敏度是有效降低基质效应的途径之一，因此本研究拟采用两种不同的思路以提高基于模拟抗原 A9及CIT单抗所建立的免疫学分析方法。本研究主要内容如下：　　1.桔霉素定量检测免疫荧光PCR方法的建立　　本文研究基于CIT模拟抗原A9噬菌体，经qPCR退火温度、扩增效率、包被单抗浓度、投入噬菌体浓度及甲醇浓度等因素的优化，成功建立了免疫荧光PCR方法。该方法对 CIT定量检测的IC50值为9.86±2.52ng/mL，相较于传统phage-ELISA在灵敏度上基本保持一致；但该方法的线性范围为0.1-1000ng/mL，相较于传统phage-ELISA拓宽10倍以上。本研究中建立的方法对常见的真菌毒素，如黄曲霉毒素B1（AFB1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、赭曲霉毒素A（OTA）及玉米赤霉烯酮（ZEN）无明显交叉反应（交叉反应率均低于0.1％）。在以面粉及米粉为基质的加标回收实验中，对两者的回收率分别介于90.0%-104.6%和75.8%-110.0%，变异系数均＜15%。利用文中建立的方法对红曲发酵液中桔霉素含量测定的结果与UPLC-MS结果无显著性差异。　　2.利用分子模拟技术寻找关键位点　　本文利用同源建模策略，建立模拟抗原A9及CIT单链抗体的三维模型。并将小分子CIT及模拟抗原A9分别与CIT单链抗体进行分子对接，最终确定模拟抗原A9中的5个关键位点：T28、F29、N30、R31和Y32。对上述5个位点同时进行丙氨酸突变后，突变子phage-ELISA结果表明：当5个位点同时突变为丙氨酸时基本上失去了与CIT单链抗体结合的能力，这一结果证实了分子对接的结果正确性。　　3.定点饱和突变子的产生及筛选　　本文利用定点饱和突变策略，在28-32及74位点上平均各产生18种携带不同氨基酸的突变子。利用间接竞争phage-ELISA方法对所有突变子进行活性鉴定，并从中筛选到T28F、T28I、F29I、F29V、N30T、N30V等6个克隆较野生型灵敏度略有提高。基于以上突变子建立了间接竞争phage-ELISA标准曲线，结果显示其IC50值较野生型分别降低1.83、1.37、1.70、2.96、1.31、2.01倍。