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目的:通过体外实验研究双氢杨梅素皮素(Ampelopsin,APS)及其与β-内酰胺类抗生素联合用药对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的抑杀作用。通过体内实验研究APS对MRSA致死及亚致死菌血症模型小鼠的保护作用。最后采用热灭活MRSA感染RAW264.7巨噬细胞研究APS抗MRSA感染作用的机制研究,及其作用机制是否与激动TLR2信号通路有关。 方法: 1.体外抗菌实验:采用96孔板培养菌液,吸光度法检测在不同的培养时间菌液的OD600,平板菌落计数法得出菌浓度,然后绘制MRSA生长曲线;用肉汤二倍稀释法测定APS及其与β-内酰胺类抗生素联合用药对MRSA的最小抑菌浓度(MIC);采用棋盘法测定APS及其与β-内酰胺类抗生素联合用药对MRSA的部分杀菌浓度(FICI);采用96孔板和平板菌落计数法测定APS对MRSA菌液作用不同时间时的杀菌曲线。 2.体内抗菌实验:采用尾静脉注射法构建MRSA致死和亚致死菌血症小鼠模型;正交试验法优化构建MRSA致死菌血症小鼠模型条件,在此模型基础上检测APS对其生存率的影响;平板菌落计数法检测血内细菌数,动物血常规分析法检测白细胞(WBC)、中性粒细胞及其百分比(NEUT、NEUT%)、单核巨噬细胞及其百分比(MONO、MONO%)、嗜酸性巨噬细胞(EO)、淋巴细胞(LYMPH)、嗜碱性巨噬细胞及其百分比(BASO、 BASO%)、血小板(PLT)的变化、脏器指数法检测小鼠脾、肾、肺、肝脏与体重比值,通过上述方法检测的指标评价APS对MRSA亚致死菌血症小鼠的保护作用;采用酶联免疫法(ELISA)测定小鼠血清中TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β炎症因子含量的变化。 3.机制研究:采用MTT法确定APS对于RAW264.7巨噬细胞的最适作用浓度范围及作用时间;继而用热灭活MRSA处理RAW264.7细胞,收集培养细胞上清,采用ELISA法检测细胞因子TNF-α、IL-6水平,同时收集细胞提取总RNA,采用RT-PCR法检测TLR2、MYD88、JNK1、P38和NF-κBmRNA表达来探讨APS抗MRSA菌血症作用机制。 结果: 1.体外抗菌实验:(1)吸光度-时间(OD600-T)曲线得出MRSA在4h~5h之间OD达到0.7~0.8,从吸光度-浓度(OD600-CFU)曲线得出OD在0.7~0.8时,细菌浓度(CFU)为5×1011~8×1012,此时细菌活力最强。(2)肉汤二倍稀释法实验结果:单用APS、泰能、头孢西丁钠、苯唑西林、青霉素G对MRSA的MIC分别为250、200、400、800、125μg/mL,MBC分别为500、800、1600、1600、500μg/mL。(3)棋盘法结果:APS的最小有效抗菌浓度为62.5μg/mL,分别使得泰能、头孢西丁钠、苯唑西林和青霉素G对MRSA的MIC降低为各药物单用MIC时的1/2、1/4、7/19和1/2。 APS与泰能、头孢西丁钠、苯唑西林和青霉素G联合应用的FICI的值分别为0.667、0.667、0.8125和0.639,表现为抗菌作用相加。(4)APS杀菌曲线得出,2MIC和4MIC的APS在10h时杀菌率达到100%,1MIC的APS在10h时的抑菌率为50%左右。说明APS在低浓度时具有抑菌作用,而在高浓度时具有杀菌作用。 2.体内抗菌实验:(1)正交试验结果表明在37℃培养MRSA至第二代,以5×1011 CFU/mL菌液浓度、每只小鼠尾静脉注射0.2mL能成功复制菌血症小鼠模型;以1×1011 CFU/mL菌液浓度、每只小鼠尾静脉注射0.2mL能成功复制亚致死菌血症小鼠模型。(2)平板菌落计数法结果表明,与空白组比较,4h、24h、48h、72h和7d时的模型组细菌数显著升高(P<0.01),24h达峰值,达到6.7×105/mL,之后呈时间渐进性减少;与模型组比较,APS高、低剂量显著降低细菌数(P<0.01)。(3) ELISA法结果显示,与空白组比较,在不同时间点模型组小鼠血清中的TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β含量均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,4h时APS高剂量显著降低TNF-α水平(p<0.01);24h时APS高、低剂量显著性降低IL-1β水平(p<0.01~0.05)和IL-6水平(p<0.01);48h时APS高、低剂量能显著降低IL-6水平(p<0.01~0.05);48h时APS高剂量显著性升高IL-10水平(p<0.01)。(4)脏器指数法结果显示,与空白组比较,模型组在4h时的肝、脾脏指数有差异(p<0.05);24h和48h时的肾、肝、脾、肺脏指数有差异(p<0.01~0.05);72h和第7d时,脾脏指数有差异(p<0.05)。与模型组比较,4h时给药组无差异;24h时APS高、低剂量组的肾脏指数有显著性降低(p<0.01~0.05);48h时APS高剂量组的肾、脾脏指数有降低(p<0.05);72h和第7d时APS高、低剂量组的脾脏指数有显著性降低(p<0.01~0.05)。(5)动物血常规结果显示,与空白组比较,在不同时间点模型组的WBC、NEUT、NEUT%、MONO、MONO%、EO、LYMPH、BASO、BASO%、PLT有差异(p<0.01~0.05);与模型组比较,在72h时APS高剂量组的WBC、PLT、LYMPH、NEUT、MONO有显著性升高差异(p<0.01),EO%、BASO%显著性降低(p<0.01),APS低剂量组的WBC、LYMPH有升高(p<0.05),BASO%显著性降低(p<0.01)。 3.机制研究:(1) MTT法实验结果显示,APS在浓度范围为15.625~7.8125μg/mL,作用24h时能显著性促进RAW264.7巨噬细胞的增殖。(2)ELISA法结果显示,热灭活MRSA菌可明显的诱导RAW264.7细胞TNF-α和IL-6的分泌,终浓度为15.625、7.8125μg/mL的APS对TNF-α抑制率分别为32.9%和16.0%(P<0.01~0.05);终浓度为15.625、7.8125μg/mL的APS对IL-6分泌的抑制率分别为35.1%和23.0%(P<0.01)。(3) RT-PCR结果显示,热灭活MRSA菌可诱导RAW264.7细胞的TLR2、MYD88、NF-κBmRNA表达升高(P<0.05),而对JNK1、P38mRNA无影响;单用APS对RAW264.7细胞的TLR2、MYD88、NF-κB mRNA、JNK1、P38mRNA无影响;但其可显著性降低热灭活MRSA对RAW264.7细胞的TLR2、MYD88、NF-κB mRNA表达(P<0.01),对JNK1、P38mRNA无影响。 结论:本课题通过实验研究表明,在体外APS能抑杀MRSA。在体内APS防治MRSA菌血症感染可能的作用机制是通过调控TLR2信号通路上TLR2、MYD88、NF-κBmRNA及TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β免疫细胞因子的表达,调节机体中的白细胞(EO、BASO、MONO、LYMPH和NEUT)、RBC、PLT和PCT等细胞数量,从而增强机体免疫应答功能,提高机体对细菌的清除及抑杀能力,达到对抗MRSA菌血症的目的。