结直肠癌是人类常见的消化道恶性肿瘤之一,据最新统计显示,其发病率和死亡率在所有类型肿瘤中居前三位,且男性患病多余女性。虽然我国结肠癌的发病率和死亡率略低于世界平均水平,但总体上呈持续上升趋势。炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一组原因未明反复发作的慢性炎症性肠道疾病,包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。IBD临床表现为慢性腹泻、腹痛,甚至便血。IBD随着病程延长,炎症程度加重,恶性癌变的风险增加。虽然IBD患者癌变只占结肠癌的1%~2%,但是结肠炎相关性肿瘤(Colitis-Associated Cancer,CAC)是IBD最为严重的并发症,并且其发生率呈逐年上升态势。上个世纪20年代,德国科学家Otto Warburg提出,肿瘤细胞即使在有氧条件下也会优先进行糖酵解为细胞提供能量,这种有别于正常组织细胞的糖代谢方式,称为“Warburg效应”,或称为“有氧糖酵解”。由于肿瘤细胞内一些基因结构与功能的改变,导致最终以Warburg效应为主要生化代谢特征的一系列代谢改变称为代谢重编程。肿瘤细胞通过基因突变可改变多种信号转导通路,从而调节肿瘤细胞代谢,主要表现为糖酵解增强、葡萄糖摄取和消耗增加、乳酸产生增加等。肿瘤细胞代谢重编程引起细胞内代谢异常,是为满足其快速增殖需求而主动发生的过程,同时改变了营养物质在代谢网络中的流向和流量。目前,代谢重编程参与结直肠癌的发生发展过程已基本明确。然而,细胞代谢重编程是否参与慢性肠道的炎症过程却不得而知。因此,我们做出了以下假设:在反复炎症刺激下,在正常上皮-炎症损伤-异常增生-腺瘤-癌变的过程中,细胞的代谢状态可能会逐渐发生改变,以适应其快速增殖和恶性增生的需要。而代谢重编程则会进一步加剧细胞的增殖和恶性转化过程,最终形成肿瘤。为此,针对以上假设,我们通过动物实验和细胞实验分别模拟炎症过程,检测代谢过程中一系列代谢指标的变化,从而明确炎性状态下是否会发生代谢重编程,并进一步揭示其分子作用机制。【目的】1.建立DSS诱导的小鼠急/慢结肠炎模型2.体内实验检测代谢关键酶的表达状态3.在细胞水平分析炎症信号刺激下的代谢变化4.揭示炎症状态下发生代谢重编程的分子机制【方法与结果】1.代谢关键酶在DSS诱导小鼠急性结肠炎模型中表达上调为了明确细胞代谢关键酶在炎症微环境中的变化规律,我们利用DSS诱导方法,分别建立小鼠急性和慢性结肠炎模型。首先,在DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型中,我们分别利用2.5%和4%DSS加入小鼠饮用水中,每天测体重,诱导肠炎7天后取结肠组织,测量结肠长度,进行组织学分析。结果显示,随着DSS作用时间延长,小鼠体重降低、结肠长度明显缩短,并在2.5%和4%两组小鼠之间也存在略微差异。此外,我们也通过结肠组织H&E染色和组织学评分来评估炎症程度。发现DSS处理组小鼠结肠组织有大量的小叶坏死性炎症细胞。据此,我们进一步检测了代谢相关指标的变化。结果发现,持续7天的DSS处理,小鼠结肠上皮细胞中HK2、PKM2的m RNA与蛋白水平表达升高,同时发现,p-STAT3与c-Myc的表达上调。2.代谢关键酶在DSS诱导小鼠慢性结肠炎模型中表达上调除了急性炎症模型,我们也建立了慢性炎症模型来分析代谢标志物的变化情况。在诱导慢性肠炎模型中,利用DSS处理小鼠三个周期。每个周期利用2.5%的DSS喂食小鼠5天,随后的10天更换为正常的无菌水。在对照组小鼠中,小鼠结肠黏膜组织学评估没有明显差异,然而在DSS处理组却有明显的异常以及大量的炎性细胞浸润。免疫组化染色结果显示,在慢性炎症状态下,c-Myc,HK2,PFK,PKM2以及pSTAT3的表达升高。值得注意的是,在糖酵解中发挥重要作用的代谢关键酶如LDHA和PKM2在慢性炎症中表达升高较为明显,但在诱导急性肠炎小鼠中的表达变化差异不大。以上这些结果说明,细胞代谢状态可在急性肠道炎症中进行波动性调整,以对抗炎症微环境的应激作用。但在长期的慢性炎症环境中,可通过代谢重编程进一步重塑代谢状态来适应细胞内外环境。3.IL-6刺激下代谢关键酶的表达以及乳酸产生量增加有研究表明,IL-6作为炎症因子在肿瘤微环境中对肿瘤细胞的增殖具有重要的促进作用。因此,我们利用人正常肠上皮细胞HIEC与结肠癌细胞为研究模型,明确IL-6对细胞代谢状态的影响及其生物学功能。我们发现,IL-6对细胞存活具有一定的促进作用,在HIEC细胞中尤为明显。在相应的细胞流式分析与平板克隆形成实验中,证实IL-6对结肠细胞生长与增殖具有直接的促进作用。同时,IL-6还可以降低5-FU对HIEC细胞的诱导凋亡能力。重要的是,在HT-29与HIEC细胞系中,IL-6刺激可以显著的提高代谢关键酶的m RNA和蛋白表达水平,LDH-A与PKM2的表达水平明显升高。相对于HIEC细胞系,IL-6刺激作用引起的代谢关键酶表达升高在SW620中较为明显,提示我们,相对于正常细胞,具有高度恶性转移能力的肿瘤细胞在炎症信号刺激下,可以更加高效的进行有氧糖酵解。此外,IL-6促使细胞产生乳酸的能力增强。我们的结论证实,与动物实验一致,IL-6作为炎症因子所诱导的炎性微环境对细胞的有氧糖酵解具有直接的促进作用。4.IL-6通过激活STAT3/c-Myc信号通路诱导代谢重编程在明确炎症可以诱导代谢重编程的基础上,我们进一步对炎症微环境下炎症-肿瘤恶性转化过程引起细胞代谢发生重编程的机制进行了深入分析。近年来研究表明,IL-6/STAT3通路在炎症相关性结肠癌的发生发展中发挥着关键作用。据此,我们利用STAT3的小分子抑制剂S3I-201抑制IL-6/STAT3信号通路。发现,S3I-201可以抑制HK2与c-Myc的表达。同时,S3I-201还可以进一步阻断IL-6对c-Myc与细胞内代谢关键酶的上调作用。由于炎症状态下c-Myc的m RNA水平与蛋白水平均表达上升,我们进一步利用c-Myc的抑制剂JQ1作用细胞。结果显示,JQ1可以抑制IL-6引发的代谢关键酶表达上调,而p-STAT3的表达不受影响。因此,我们认为IL-6/STAT3信号通路可以诱导代谢发生重编程,而STAT3/c-Myc信号通路在炎症诱导代谢重编程的过程中发挥关键作用。【结论】我们研究发现,在DSS诱导的小鼠急性和慢性肠道炎症模型中,炎症信号可以诱导代谢重编程。但是,在急性炎症与慢性炎症模型中略有差异。在急性炎症的早期阶段,糖酵解过程中开始几步的代谢酶变化较后几步较为明显,而在慢性炎症中则是更多的代谢关键酶持续高表达,提示我们长期的炎症信号的持续刺激有可能导致代谢重编程。同时,我们在体外细胞模型中,发现IL-6作为炎症因子所诱导的炎性微环境对细胞的有氧糖酵解具有直接的促进作用,并且证实IL-6/STAT3/c-Myc在此过程中发挥关键作用。综上所述,我们研究发现炎症可以促使肠道上皮细胞发生代谢重编程。这些代谢状态的改变,其特点类似于“Warburg效应”或有氧糖酵解,例如糖酵解能力增强、乳酸产生增加,可以进一步促进炎症相关性结肠癌的发生发展过程。因此,炎症诱发的肠上皮细胞代谢特征性改变,可能成为炎症相关性结肠癌早期诊断的标志物和潜在的治疗靶点。