论文部分内容阅读
混合物筛选可解决传统纯化合物筛选耗费较大问题，但现有方法无法发现混合物库中低丰度高亲和力配体，为此前期基于磁珠固定化靶蛋白，提出亲和力驱动迭代指数富集技术(Affinity Based Iterative Exponential Enrichment，ABIEE)。以链亲和素-生物素为模型，建立fM级抑制剂筛选模型；以结核分枝杆菌二氢叶酸还原酶(Mycobacterium tuberculosiSDihydrofolate reductase，MtDHFR)-甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)为模型，建立nM级抑制剂筛选模型，均在模拟混合物库中证明其适用性。本文旨在优化多种磁珠固定化不同靶蛋白方案，总结固定化规律，利用固定化MtDHFR指数富集筛选甲氨蝶呤衍生物、嘧啶类液相组合合成大容量混合物中潜在配体，探索筛选姜黄、猫爪草中有效成分，推进ABIEE的应用。
构建结核分枝杆菌甲硫氨酸氨肽酶(MtMetAP1c)，人源谷胱甘-S-转移酶P1(hGSTP1)，人源谷胱甘-S-转移酶M2(hGSTPM2)表达质粒，在E.coliBL21(DE3)中成功重组表达并表征酶学性质。选择活化后等电点不同的两种兼性离子修饰亲水羧基磁珠(MSP-COOH-F1/Z1)，以MtDHFR为模型蛋白，讨论在不同pH缓冲液中固定化速率、饱和固载量及对应蛋白投料量差异，发现静电吸引作用加速固定化过程，能较快达到饱和固定化，再比较hGSTM2(pI 6.54)、hGSTP1(pI 8.92)固定化，均表明MSP-COOH-F1更优。MSP-COOH-F1固定化hGSTM2保留酶活最高(89.0±4.9)%(n=3)，固载容量为(6.7±0.1)mg/g磁珠(n=3)，对应投料比为10mg/g磁珠(n=3)；在酶缓冲液中24h活性保持稳定，对单价抑制剂依他尼酸(Ethacrynic Acid，EA)响应(IC50)同游离酶无显著性差异，但对二价抑制剂双依他尼酸乙醇胺(Aminoethanol Di-Ethacrynic Acid，ADEA)IC50增大1个数量级。可能是羧基固定化改变了hGSTM2取向而使ADEA不能完全结合两个活性位点，亲和力降低。对hGSTP1，两种羧基磁珠固定化保留酶活均低于30%，可能是45位赖氨酸固定化导致与底物GSH结合活性降低，故羧基磁珠不适合固定化活性位点附近含活泼氨基酸残基的蛋白。再用Ni2+-NTA磁珠固定化三种蛋白，hGSTM2和hGSTP1的饱和固载容量分别为(85.4±1.4)mg/g，(92.1±2.2)mg/g磁珠(n=3)，但保留酶活仅(55.4±2.6)%和(37.4±0.5)%(n=3)；当固载容量为(26.8±0.3)mg/g、(25.6±0.9)mg/g磁珠(n=3)，对应投料比为30mg/g磁珠时，二者最高保留酶活>77%，且在酶缓冲液中8h内活性保持稳定，耐受甲醇加热。Ni2+-NTA磁珠固定化hGSTP1和hGSTM2对单价或二价抑制剂响应无显著性差异。对于MtMetAP1c，用Ni2+-NTA磁珠固定化后经SDS-PAGE证明纯度进一步提高，其固载容量为(63.9±21.1)mg/g磁珠(n=3)，表观保留酶活约为(60.5±10.1)%(n=3)。因此，Ni2+-NTA磁珠针对6×His标签在GST二聚体和较低纯度蛋白固定化更具优势。
以MSP-COOH-F1固定化MtDHFR为靶蛋白，富集发现合成甲氨蝶呤双乙酯(EST)中残留高亲和力MTX(HPLC-MS/MS丰度<3%)符合ABIEE效应，且经两轮富集发现丰度更低、亲和力低6倍的γ-甲氨蝶呤单乙酯(γ-EST)，所得亲和力与合成的γ-EST纯品相近。
固定化MtDHFR筛选液相组合合成嘧啶类衍生物大库(>900个)。控制筛选前样品平均浓度，按平均回收率30%，靶蛋白递减序列30倍，迭代亲和富集筛选3轮，UPLC-TripleTOF-MS/MS跟踪，定性分析峰强度随迭代富集浓度差异，初步获得8个候选化合物。用Autodock1.5.6和DiscoveryStudio3.0软件将蛋白和候选化合物对接，两种虚拟筛选均得到最优结构3-B11-A16，需要进一步合成验证。
姜黄75%乙醇提取物和猫爪草石油醚提取物中人工添加MTX和EST，探索固定化MtDHFR基于ABIEE筛选天然产物。两种提取物中MTX被选择性富集，反向验证姜黄素对MtDHFR抑制能力很弱，两种提取物尚未发现其余高亲和力抑制剂，存在成分过于复杂和含量过低导致漏筛可能，可优化提取溶剂或初步分级后再行筛选。
综上所述，通过优化不同表面官能团的兼性离子修饰亲水磁珠固定化靶蛋白方案，提示磁珠固定化需要考虑靶蛋白结构、磁珠和靶蛋白pI、固定化溶液pH、固定化位点是否影响蛋白空间结构、固定化蛋白稳定性，以最高保留酶活选择最适投料比。利用固定化MtDHFR为靶，初步证明ABIEE技术筛选不同容量混合物中未知低丰度高亲和力抑制剂的可行性，并具有筛选效率高、成本低等优势。基于MtDHFR组合合成库筛选结果进一步合成验证或优化筛选天然产物粗分级混合物有望得到抗结核作用的先导化合物。
构建结核分枝杆菌甲硫氨酸氨肽酶(MtMetAP1c)，人源谷胱甘-S-转移酶P1(hGSTP1)，人源谷胱甘-S-转移酶M2(hGSTPM2)表达质粒，在E.coliBL21(DE3)中成功重组表达并表征酶学性质。选择活化后等电点不同的两种兼性离子修饰亲水羧基磁珠(MSP-COOH-F1/Z1)，以MtDHFR为模型蛋白，讨论在不同pH缓冲液中固定化速率、饱和固载量及对应蛋白投料量差异，发现静电吸引作用加速固定化过程，能较快达到饱和固定化，再比较hGSTM2(pI 6.54)、hGSTP1(pI 8.92)固定化，均表明MSP-COOH-F1更优。MSP-COOH-F1固定化hGSTM2保留酶活最高(89.0±4.9)%(n=3)，固载容量为(6.7±0.1)mg/g磁珠(n=3)，对应投料比为10mg/g磁珠(n=3)；在酶缓冲液中24h活性保持稳定，对单价抑制剂依他尼酸(Ethacrynic Acid，EA)响应(IC50)同游离酶无显著性差异，但对二价抑制剂双依他尼酸乙醇胺(Aminoethanol Di-Ethacrynic Acid，ADEA)IC50增大1个数量级。可能是羧基固定化改变了hGSTM2取向而使ADEA不能完全结合两个活性位点，亲和力降低。对hGSTP1，两种羧基磁珠固定化保留酶活均低于30%，可能是45位赖氨酸固定化导致与底物GSH结合活性降低，故羧基磁珠不适合固定化活性位点附近含活泼氨基酸残基的蛋白。再用Ni2+-NTA磁珠固定化三种蛋白，hGSTM2和hGSTP1的饱和固载容量分别为(85.4±1.4)mg/g，(92.1±2.2)mg/g磁珠(n=3)，但保留酶活仅(55.4±2.6)%和(37.4±0.5)%(n=3)；当固载容量为(26.8±0.3)mg/g、(25.6±0.9)mg/g磁珠(n=3)，对应投料比为30mg/g磁珠时，二者最高保留酶活>77%，且在酶缓冲液中8h内活性保持稳定，耐受甲醇加热。Ni2+-NTA磁珠固定化hGSTP1和hGSTM2对单价或二价抑制剂响应无显著性差异。对于MtMetAP1c，用Ni2+-NTA磁珠固定化后经SDS-PAGE证明纯度进一步提高，其固载容量为(63.9±21.1)mg/g磁珠(n=3)，表观保留酶活约为(60.5±10.1)%(n=3)。因此，Ni2+-NTA磁珠针对6×His标签在GST二聚体和较低纯度蛋白固定化更具优势。
以MSP-COOH-F1固定化MtDHFR为靶蛋白，富集发现合成甲氨蝶呤双乙酯(EST)中残留高亲和力MTX(HPLC-MS/MS丰度<3%)符合ABIEE效应，且经两轮富集发现丰度更低、亲和力低6倍的γ-甲氨蝶呤单乙酯(γ-EST)，所得亲和力与合成的γ-EST纯品相近。
固定化MtDHFR筛选液相组合合成嘧啶类衍生物大库(>900个)。控制筛选前样品平均浓度，按平均回收率30%，靶蛋白递减序列30倍，迭代亲和富集筛选3轮，UPLC-TripleTOF-MS/MS跟踪，定性分析峰强度随迭代富集浓度差异，初步获得8个候选化合物。用Autodock1.5.6和DiscoveryStudio3.0软件将蛋白和候选化合物对接，两种虚拟筛选均得到最优结构3-B11-A16，需要进一步合成验证。
姜黄75%乙醇提取物和猫爪草石油醚提取物中人工添加MTX和EST，探索固定化MtDHFR基于ABIEE筛选天然产物。两种提取物中MTX被选择性富集，反向验证姜黄素对MtDHFR抑制能力很弱，两种提取物尚未发现其余高亲和力抑制剂，存在成分过于复杂和含量过低导致漏筛可能，可优化提取溶剂或初步分级后再行筛选。
综上所述，通过优化不同表面官能团的兼性离子修饰亲水磁珠固定化靶蛋白方案，提示磁珠固定化需要考虑靶蛋白结构、磁珠和靶蛋白pI、固定化溶液pH、固定化位点是否影响蛋白空间结构、固定化蛋白稳定性，以最高保留酶活选择最适投料比。利用固定化MtDHFR为靶，初步证明ABIEE技术筛选不同容量混合物中未知低丰度高亲和力抑制剂的可行性，并具有筛选效率高、成本低等优势。基于MtDHFR组合合成库筛选结果进一步合成验证或优化筛选天然产物粗分级混合物有望得到抗结核作用的先导化合物。