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香气是影响烟叶品质的重要指标,明确香气物质合成途径与调控基因,培育高香气品种对烟草行业的持续发展具有重要意义。冷杉醇属于赖百当二萜,是大部分香料烟和部分雪茄烟中特有的香气前体物,其降解产物对增加卷烟香气和吸味非常有效,常用于卷烟浸膏中,但烤烟、白肋烟、马里兰烟等一般不含有。常规育种手段由于目标香气性状的鉴定费用较高等原因,冷杉醇优异香气性状在烤烟香气品质育种中受到较大限制。此外,有研究表明冷杉醇关键合成基因与黑胫病抗性主效位点紧密连锁。鉴于此,本研究拟通过转基因技术明确调控冷杉醇合成的基因在烤烟中的功能以及获得含冷杉醇的烤烟种质的最简单有效的转基因模式,并鉴定冷杉醇合成基因与烟草黑胫病抗性的关系;同时开发冷杉醇关键调控基因的分子标记用于种质资源筛选与分子标记辅助选择育种,为下一步含冷杉醇烤烟种质资源的创建及优异烤烟品种培育提供研究基础。主要结果如下。1.分析冷杉醇合成基因NtCPS2和NtABS在Samsun腺毛和去除腺毛叶片中相对表达量和红花大金元腺毛和去除腺毛叶片中的相对表达量。结果表明,无论在Samsun或红花大金元中,这两个基因在腺毛中的表达量均显著高于去除腺毛的叶片(400-900倍),证明NtCPS2和NtABS是腺毛特异表达基因,且同一基因在不同品种间,两个不同基因在同一品种间的表达具有差异性。2.克隆了冷杉醇合成基因NtCPS2和Nt ABS,利用酶切法成功构建了单基因NtCPS2过表达载体、单基因NtABS过表达载体和双基因(NtCPS2和Nt ABS)共过表达载体,并通过农杆菌介导法将目的基因导入到红花大金元中。筛选得到NtCPS2阳性植株6株,NtABS阳性植株5株,NtABS和Nt CPS2阳性植株4株。荧光定量PCR对阳性植株作表达量分析,筛选到相对表达量10-80倍的植株。3.基于等位基因特异PCR设计了14条前引物和一条后引物,每条前引物在不同的位置引入不同的错配碱基,共组成14对标记引物;对比了这些引物对在亲本Beinhart 1000-1和Speight G-28中的扩增效果,筛选到引物对1F/R1和8F/R1具有较好的特异性,同时说明在引物3’末端倒数第三位引入错配碱基的扩增效果要好于在倒数第二位引入错配碱基,引物3’末端连续引入两个错配碱基大大降低了引物与模板的结合能力;对引物对1F/R1和8F/R1进行PCR体系优化,提高了其扩增效果;进一步在六个亲本材料和F1群体验证引物对1F/R1和8F/R1,说明其可作为分子标记用于种质鉴定和分子标记辅助选择育种。4.利用开发的两对分子标记对47份(1-47号)主栽烤烟品种和98份高香气EMS诱变突变体进行基因型鉴定,结合GC-MS表型鉴定和测序分析,得到4份含有冷杉醇的种质材料,分别是大白筋599、革新三号、NC2326和一个突变体株系TBT6;进一步对48份(48-95号)烤烟种质进行基因型鉴定,得到含有冷杉醇材料铁耙子、86-3002、82-3041、7514、C151、7411、CV58、CF90NF、Cash、Harrison Special、SH.86-1和78-3012。筛选获得的含有冷杉醇的烤烟种质为特色香气烤烟品种培育提供了有价值的种质材料。对TBT6株系后代群体(含有28个单株)进行基因分型鉴定,得到G/G纯合体(含冷杉醇)6株,G/T杂合体(含冷杉醇)16株,T/T纯合体(不含冷杉醇)4株,无扩增条带2株,分子标记辅助选择加速了后代群体目标性状纯合的速率。