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目的:乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,严重危害着女性的生命和健康。近年来我国乳腺癌的发病率持续上升,且发病年龄呈年轻化。乳腺癌是内分泌依赖性肿瘤,雌激素会刺激乳腺癌的发生与发展,并增加乳腺癌的复发和转移的机率。相比于细胞毒性药物治疗,内分泌治疗具有其副作用小、方便服用、效应持久,对患者生活质量影响小等优点,成为乳腺癌最重要的治疗手段之一。他莫昔芬(三苯氧胺,tamoxifen TAM)是一种选择性雌激素受体调变剂,用于绝经前雌激素受体(estrogen receptor,ER)阳性的乳腺癌患者的内分泌治疗。目前临床上约40%~50%ER阳性的乳腺癌患者对抗雌激素治疗产生耐药。但TAM耐药机制尚不明确,ER的丢失和变异并不能完全解释TAM抵抗。本课题的前期研究发现,抗雌激素药物——他莫昔芬调节Cerb B-2基因表达,继而调节乳腺肿瘤细胞生长。在此过程中,有两个基因:PAX2(配对盒基因,Paired box gene)及AIB-1(Amplified in breast cancer 1,又称SRC-3)起到很重要的介导作用。研究发现PAX-2与AIB-1竞争性结合ER受体以调控HER-2的转录,从而决定他莫昔芬对乳腺癌内分泌治疗的有效性。鉴于此,本文对PAX2和AIB1在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞生长及他莫昔芬耐药中的作用进行了较为系统的实验研究。方法:1 PAX-2、AIB-1基因重组质粒稳定转染MCF-7细胞株的建立1.1细胞稳定转染:将PAX-2、AIB-1基因的重组质粒(EX-Z4450-M90(PAX-2)、EX-Z5301-M90(AIB-1))大量提纯。通过脂质体介导的方法将质粒转染入人乳腺癌MCF-7细胞,经嘌呤霉素加压筛选4-5周,分别得到稳定高表达PAX-2、AIB-1基因的新乳腺癌细胞株(命名为MCF-7-PAX-2、MCF-7-AIB-1)。设立阴性质粒[EX-NEG-M90(空载)]稳定转染的MCF-7细胞株为对照(命名为MCF-7-空载)。通过绿色荧光蛋白GFP检测细胞转染效率。1.2稳定转染细胞株的验证:实验分组:未处理组(MCF-7细胞);空载组(MCF-7-空载);对照组1(MCF-7-AIB1);对照组2(MCF-7-PAX2)。采用RT-PCR、Western blot方法分别检测四组细胞株PAX2m RNA、AIB1m RNA及PAX2、AIB1蛋白表达量,以验证获得的细胞株为稳定转染细胞株。2稳定转染后细胞的体内增殖能力及耐药性的研究2.1稳定转染细胞荷瘤裸鼠模型的建立和肿瘤体积的测量将稳定转染细胞制备成单细胞悬液,于裸鼠于右侧背部皮下注射细胞悬液,使接种细胞总数为1.5×107个/只。接种后观察到肿瘤生长,按公式计算肿瘤体积(Tumor Volume)TV=1/2×LW2。待接种7周后给予他莫昔芬灌胃,观察处理后肿瘤生长情况。2.2裸鼠成瘤标本检测接种12周后处死小鼠,取出皮下肿瘤,HE染色结果证实为接种瘤。同时,提取裸鼠肿瘤组织总RNA和总蛋白,进行Western Blot和Real time PCR检测PAX2、AIB1、HER2及增殖相关因子ki-67的表达情况。应用免疫组化对PAX2、AIB1、HER-2、ki-67特异性表达情况进行检测。3统计学分析每组实验不少于3次独立样本的重复,采用SPSS软件(13.0)进行单因素方差分析(analysis of variance,ANOVA)和非参数检验,数据用均数±标准差表示,检验以P<0.05为差异有显著性意义。结果:1质粒提纯情况①提纯的EX-Z4450-M90(PAX-2)、EX-Z5301-M90(AIB-1)、EX-NEG-M90(空载)质粒进行琼脂糖凝胶电泳,获得约与目的大小一致的条带。②紫外分光光度仪法测定EX-Z4450-M90(PAX-2)、EX-Z5301-M90(AIB-1)、EX-NEG-M90(空载)质粒浓度分别为684μg/ml,OD260/OD280值为1.956;598μg/ml,OD260/OD280值为1.942;962μg/ml,OD260/OD280值为1.959。质粒提纯成功,纯度高,浓度高,可用于细胞转染。③提纯质粒进行检测,质粒所测部分碱基序列无错误。2转染效率通过绿色荧光蛋白GFP检测,MCF-7-PAX-2细胞、MCF-7-AIB-1细胞、MCF-7-空载细胞转染效率均达80%左右。3稳转株PAX2、AIB1基因m RNA表达情况RT-PCR结果显示:与未处理组相比,MCF-7-PAX-2细胞PAX-2mRNA明显升高,升高至321.08倍(P<0.05);AIB-1 m RNA无明显变化。MCF-7-AIB-1细胞AIB-1 m RNA明显升高,599.665倍(P<0.05);PAX-2m RNA无明显变化。MCF-7-空载细胞PAX-2m RNA、AIB-1 m RNA均无明显变化。4稳转株PAX2、AIB1蛋白表达情况Western blot结果显示:与未处理组相比,MCF-7-PAX-2细胞PAX-2蛋白相对表达量为1.677±0.346,明显升高,升高了67.7%(P<0.05);AIB-1蛋白相对表达量为1.162±0.145,无明显变化。MCF-7-AIB-1细胞AIB-1蛋白相对表达量为2.446±1.207,明显升高,升高了144.56%(P<0.05);PAX-2蛋白相对表达量为1.059±0.030,无明显变化。MCF-7-空载细胞PAX-2蛋白相对表达量为1.035±0.040,AIB-1蛋白相对表达量为1.172±0.258均无明显变化(P>0.05)。5瘤体积测量结果:①接种3周后四组小鼠均形成肿瘤。②接种5周后,各组间瘤体积即出现明显区别。与未处理组相比,MCF-7-PAX-2组肿瘤明显小于未处理组,瘤体积小于7.36%(P<0.05);MCF-7-AIB-1组肿瘤明显大于未处理组,瘤体积大于13.09%(P<0.05);而MCF-7-空载组和未处理组相比差异无显著性(P>0.05)。③接种7周后,与未处理组相比,MCF-7-PAX-2组肿瘤体积为876.76±48.11,明显小于未处理组,瘤体积小于15.69%(P<0.05);MCF-7-AIB-1组肿瘤体积为1596.99±64.97,明显大于未处理组,瘤体积大于53.57%(P<0.05);而MCF-7-空载组肿瘤体积为1101.99±93.3,与未处理组相比差异无显著性(P>0.05)。④他莫昔芬灌胃5周后,与处理组相比,MCF-7-PAX-2组肿瘤生长速度明显小于未处理组,27.5%(P<0.05);MCF-7-AIB-1组肿瘤生长速度明显大于未处理组,125.75%(P<0.05);而MCF-7-空载组和未处理组相比差异无显著性(P>0.05)。6接种瘤HE和免疫组化结果:①HE染色观察实验组和未处理组细胞形成的皮下肿瘤组织恶性程度无明显差异,均可见高分裂像,瘤细胞排列密集形状近于卵圆形或多边形。②免疫组化显示,四组肿瘤PAX-2、AIB-1、HER-2、ki-67均为阳性。与未处理组相比,MCF-7-PAX-2组肿瘤PAX-2强阳性表达率高(P<0.05),HER2强阳性表达率低(p<0.05),AIB-1、Ki-67均无显著差异(P>0.05);MCF-7-AIB-1组肿瘤AIB-1强阳性表达率高(p<0.05),HER2、PAX-2、ki-67均无显著差异(P>0.05);而MCF-7-空载细胞和未处理组相比差异无显著性P>0.05)。7接种瘤RT-PCR结果显示:与未处理组相比,MCF-7-PAX-2组肿瘤PAX-2m RNA明显升高,升高13315.24%(P<0.05),AIB-1m RNA、HER2m RNA显著降低,分别降低67.16%、54.63%(P>0.05);MCF-7-AIB-1组肿瘤AIB-1 m RNA、HER2m RNA明显升高,分别升高5801.77%、538.49%(P<0.05),PAX-2m RNA显著降低,降低28.9%(P>0.05);MCF-7-空载组肿瘤PAX-2m RNA、AIB-1m RNA、HER2m RNA和未处理组相比差异无显著性(P>0.05)。8接种瘤Western blot结果显示:与未处理组相比,MCF-7-PAX-2组肿瘤PAX-2阳性表达率升高91.06%(P<0.05),AIB-1、HER2阳性表达率分别降低33.86%、38.65%(P<0.05),Ki-67均无显著差异(P>0.05);MCF-7-AIB-1组肿瘤AIB-1、HER2阳性表达率分别升高256.71%、270.23%(P<0.05),PAX-2阳性表达率降低71.72%(P<0.05),Ki-67无显著差异(P>0.05);MCF-7-空载肿瘤组PAX-2、AIB-1、HER2表达情况和未处理组相比差异无显著性(P>0.05)。结论:1 AIB-1高表达可促进ER阳性乳腺癌MCF-7细胞在体内的生长,PAX-2高表达可抑制MCF-7细胞在体内的生长。2 AIB-1高表达可导致ER阳性乳腺癌MCF-7细胞对于TAM的敏感性降低,PAX-2高表达可促进MCF-7细胞对于TAM的药物敏感性。3 AIB-1高表达可促进HER-2的表达,PAX-2高表达可抑制HER-2的表达。4 AIB-1高表达或PAX-2高表达均不影响ki-67的表达。5 PAX-2高表达及AIB-1低表达均有助于改善TAM药物疗效和耐药状态;预示了AIB-1和PAX-2可能作为乳腺癌内分泌治疗疗效及耐药的预测指标;并可成为TAM耐药患者新的基因治疗靶点。