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【目的】腾冲嗜热厌氧杆菌(T.tengcongensis)是从我国云南腾冲温泉中分离出的一株嗜热厌氧革兰氏阴性杆菌,也是第一个由我国自主完成基因组测序和基因注释的原核微生物。SSB1、SSB2、SSB3是腾冲嗜热厌氧杆菌中被注释的3个单链DNA结合蛋白,其中SSB1是由tte0829基因编码。体外研究发现,SSB1蛋白具有复杂的受多环境因子调控的体外生化功能,它能结合ssDNA、dsDNA和损伤的ds DNA,也可以对ssDNA上特异位点进行切割。由于SSB1同时具有单链DNA结合活性和单链DNA切割活性的双功能作用而被称为EndoTT。然而腾冲嗜热厌氧杆菌EndoTT在体内有何生理功能及在热适应过程中发挥什么样的作用仍不清楚,本试验为揭示EndoTT在不同温度下的功能及其互作蛋白对其影响可提供一定的实验依据和奠定理论基础。【方法】(1)应用同源重组分别构建EndoTT双功能回补质粒ΔendoTT::endoTT、单链DNA结合回补质粒ΔendoTT::endo TTB和单链DAN切割回补质粒Δendo TT::endo TTS,分别将3个回补质粒转入WT和ΔendoTT菌液中,在60℃培养,然后转入腾冲嗜热厌氧杆菌固体培养基中,挑选转化子,提取基因组进行PCR验证。(2)通过表型观察野生株WT、ΔendoTT::endoTT、ΔendoTT::endoTTB、ΔendoTT::endoTTS菌株在75℃和80℃的生长趋势。(3)通过RNA测序对腾冲嗜热厌氧杆菌WT和ΔendoTT在50℃、60℃、75℃和80℃生长条件下的转录组进行分析,定义ΔendoTT在不同温度下的差异表达基因,挑选其特定温度下转录丰度高的基因。(4)通过Real-time PCR分析ΔendoTT中特定温度下转录丰度高的基因的mRNA表达量。【结果】(1)在ΔendoTT基础上成功构建了EndoTT双功能回补株ΔendoTT::endoTT、单链DNA结合活性回补株ΔendoTT::endoTTB和单链DAN切割活性回补株ΔendoTT::endoTTS。(2)生长曲线结果显示在75℃和80℃条件下ΔendoTT::endoTTB生长速度慢于ΔendoTT::endo TTS。(3)腾冲嗜热厌氧杆菌WT和ΔendoTT生长在50℃、60℃、75℃和80℃条件下的转录组RNA测序分析,显示501个差异表达基因(包括296个基因在特定温度下显著表达)可能与EndoTT有着联系甚至与热适应有关;利用GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)对差异表达基因进行分析,认为信号转导、脂肪酸合成和ABC转运系统在腾冲嗜热厌氧杆菌的热适应过程中起到重要作用。(4)Real time-PCR分析ΔendoTT转录组中在特定温度下转录丰都高的tte0270、celA、argH、argC、oppF3、purR3基因,发现tte0270、argH在50℃和60℃显著表达,celA、argC只在60℃显著表达,purR3在75℃和80℃显著表达,opp F3只在80℃显著表达。【结论】成功构建了EndoTT不同功能的回补株,具有单链DNA切割活性的ΔendoTT::endoTTS在高温条件下生长快,推测EndoTT在高温下主要发挥单链切割作用。4个温度下的ΔendoTT转录组分析,定义了501个差异表达基因,涉及到糖代谢、氨基酸代谢、ABC转运系统等途径,且发现tte0270、celA、argH、argC、oppF3、purR3基因在不同温度下差异显著表达,提示这些基因编码的蛋白可能与EndoTT存在相互作用而影响其功能的发挥。