论文部分内容阅读
猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)是由猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)引起的严重危害养殖的重要传染病。PCV2感染后造成机体产生强烈的免疫抑制,引起多种病原体的继发/混合感染,给 PCVD 的防控带来更大的挑战。PCV2基因组全长1767 bp或1768 bp,为闭合的单链环状DNA病毒,病毒粒子具有二十面体结构,无囊膜。PCV2在分类上属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)成员。PCV2基因组中存在多个开放阅读框(Open reading frame,ORF),对其编码蛋白功能的阐明是揭示病毒致病机理的基础,目前已经有6个ORFs被发现和研究。ORF1是PCV2基因组中最大的开放阅读框,编码病毒复制酶Rep和Rep’蛋白,与PCV2的复制相关。ORF2编码病毒核衣壳蛋白Cap,组成病毒的基本结构,在病毒感染过程中具有多种功能,参与机体的免疫应答活动。ORF3 编码的蛋白能促进宿主细胞P53蛋白大量积聚,诱导细胞凋亡的发生。ORF4编码的蛋白具有拮抗细胞凋亡的作用。ORF6编码的蛋白能够上调多种细胞因子的表达,同时也参与细胞凋亡。本研究团队发现和鉴定了PCV2基因组中的一个新的ORF,将其命名为ORF5,该ORF基因全长180 bp,编码蛋白在诱导内质网应激、细胞自噬和细胞周期调控方面可能具有重要作用,但其确切功能尚不清楚。ORF5蛋白功能的发挥离不开宿主细胞内的互作蛋白,筛选和鉴定与ORF5蛋白互作的胞内蛋白、研究其在PCV2感染中的作用,将为揭示PCV2的感染及致病机理、发现新的宿主靶点和研发防控新药物等提供更多的理论支持。 本研究通过高通量测序技术对猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages 3D4/2, PAMs)中可能与ORF5互作的蛋白进行筛选和鉴定,对获得的胞内蛋白-跨膜糖蛋白NMB前体(Transmembrane glycoprotein NMB precursor,GPNMB)在PCV2复制中的作用进行了研究,分析了其可能的作用机制。本研究获得以下结果: (1)通过高通量测序技术获得表达ORF5 蛋白(PAM-ORF5)和接种 PCV2 (PAM-PCV2)的PAMs的转录组数据。发现在PAM-PCV2和PAM-ORF5中均出现的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)共104个,其中上调为24个,下调为80个,多数参与细胞信号转导、蛋白翻译和细胞周期等生命活动。在Go功能分类中,PAM-ORF5中的上调DEGs与蛋白结合转录因子活动与连接活动的相关性最高,下调基因与代谢活动及信号活动的相关性最高。PAM-ORF5中的DEGs多数富集在病毒心肌炎、蛋白消化和吸收、扩张性心肌病等通路,PAM-PCV2中的DEGs多数富集在心肌收缩、络氨酸新陈代谢等通路,细胞周期通路为唯一的只于PAM-ORF5中富集的通路。 (2)PAM-ORF5和PAM-PCV2中均发现GPNMB出现下调,结合前期ORF5蛋白酵母双杂交互作蛋白的筛选结果,我们认为GPNMB极可能是ORF5蛋白的一个胞内互作蛋白。在PCV2感染猪的不同组织中也检测到GPNMB的表达,且与PCV2的荷载量呈现负相关。 (3)ORF5蛋白与GPNMB存在互作。通过激光共聚焦显微镜观察到ORF5蛋白与GPNMB 在细胞中存在共定位,外源和内源性的免疫共沉淀试验(Co-immuno precipitatition,Co-IP)发现 ORF5 蛋白与 GPNMB 存在相互作用,GST 蛋白沉降技术(GST-pulldown)实验进一步证实两者之间存在直接的相互作用。 (4)GPNMB对PCV2的复制具有抑制作用。通过在过表达和调低宿主细胞GPNMB的基础上,接种PCV2后检测病毒核酸和蛋白,发现GPNMB具有抑制PCV2复制的作用。GPNMB可以使宿主细胞S期进程显著缩短,细胞周期蛋白Cyclin A的表达显著上调,使细胞的周期缩短,这可能是抑制PCV2复制的一个原因。 综上所述,PCV2 ORF5能够引起宿主细胞内多种蛋白及通路异常,其相互作用蛋白GPNMB能够抑制PCV2的复制,并且这一抑制作用可能是通过促进细胞周期进程来实现。