论文部分内容阅读
背景:恶性胶质瘤是成人颅内最常见和致命的肿瘤。虽然不同患者的生存期存在差异,但总的来讲患者预后不佳。由于近年来胶质瘤个体化、精准化治疗的普及及诊治水平的提高,过去5年胶质母细胞瘤这种最具侵袭性的胶质瘤患者的平均生存期从10个月提高到惊人的14个月。最近的研究在分子靶向治疗方面取得了许多重要成果,但是胶质瘤的潜在分子机制在很大程度上仍然是未知的。因此,揭示胶质瘤发生的分子机制才能更好地制定有效的治疗方法。ECT2(上皮细胞转化序列2)最早由Miki等于1993年发现的癌基因,已有研究证明ECT2在体内许多肿瘤中起着至关重要的作用。课题组前期预实验结果显示ECT2在脑胶质瘤中高表达,并影响脑胶质瘤患者的预后,通过体外实验我们发现ECT2能影响胶质瘤的增殖和周期,但是具体机制并不清楚。2017年Cancer Research上的一篇报道显示PTTG1(垂体肿瘤转化基因1)在垂体瘤及其他脑肿瘤中高表达,实验结果显示PTTG1在胶质瘤也是高表达的,且能促进胶质瘤的增殖。有文献报道在透明细胞肾癌中PTTG1通过影响ECT2的表达进而影响小G蛋白的活化,从而影响肾癌细胞的增殖。本课题组经实验发现在脑胶质瘤中并不存在这样的情况,但是ECT2却可以影响PTTG1的表达。那么ECT2是通过什么机制来影响PTTG1的表达的呢?转录因子E2F1被证明在垂体瘤中能促进PTTG1的表达,实验结果表明在胶质瘤中ECT2可以通过影响E2F1的降解来影响PTTG1的表达,然后我们通过设计实验进一步探讨了ECT2影响E2F1降解的机制,最终证明ECT2是通过影响去泛素化酶PSMD14来影响E2F1的降解的,最终证明了胶质瘤中ECT2/PSMD14/E2F1/PTTG1这样的一条影响肿瘤细胞增殖的通路的存在。目的:1、研究PTTG1在脑胶质瘤中的表达以及对患者预后的影响,PTTG1对脑胶质瘤细胞增殖和周期的影响;2、miR-520d-5p在脑胶质瘤中的表达以及对胶质瘤增殖的影响,miR-520d-5p与PTTG1的关系,也即miR-520d-5p是否通过靶向PTTG1影响胶质瘤细胞的增殖;3、ECT2在胶质瘤细胞中的表达,ECT2和PTTG1的相关性,ECT2是通过怎样的机制来影响PTTG1,从而影响胶质瘤细胞的增殖的。方法:1、通过胶质瘤数据库分析miR-520d-5p、PTTG1的表达情况以及对胶质母细胞瘤患者预后的影响情况;2、通过RT-PCR和荧光原位杂交(FISH)技术检测胶质瘤临床组织样本中miR-520d-5p的表达情况,WB检测临床组织样本中PTTG1的表达情况,通过Spearman相关性分析法分析miR-520d-5p和PTTG1的相关性;3、在胶质瘤细胞系中过表达miR-520d-5p或干扰PTTG1后通过CCK8、EDU、平板克隆实验和流式细胞术检测两者对胶质瘤细胞增殖和周期的影响;4、通过靶基因预测软件分析PTTG1 mRNA的3’-UTR区miR-520d-5p的结合位点,设计荧光素酶报告基因实验和回复实验验证PTTG1是miR-520d-5p直接的靶基因;5、动物实验验证miR-520d-5p通过靶向PTTG1影响胶质瘤细胞的增殖;6、数据库分析ECT2在胶质瘤中的表达和对患者预后的影响;7、WB、RT-PCR实验验证ECT2通过影响E2F1进而影响PTTG1的表达;8、通过泛素蛋白酶体抑制剂和溶酶体抑制剂证明E2F1的降解主要是通过泛素蛋白酶体途径降解;9、通过WB检测ECT2干扰或者过表达后E2F1的降解的情况;10、免疫共沉淀证明去泛素化酶PSMD14与E2F1能相互结合以及ECT2通过PSMD14影响E2F1的泛素化降解。结果:1、通过数据库分析发现PTTG1在胶质瘤中高表达,且能影响胶质母细胞瘤患者的预后;2、通过GO分析和Pathway分析发现PTTG1与胶质瘤的增殖密切想关;3、增殖相关的体外功能实验证实PTTG1促进胶质瘤细胞的增殖;4、miR-520d-5p在胶质瘤中低表达,与PTTG1的表达呈负相关;5、靶基因预测软件提示PTTG1是miR-520d-5p的靶基因;6、荧光素酶报告基因实验和回复实验证实miR-520d-5p通过靶向PTTG1影响胶质瘤细胞的增殖;7、ECT2在胶质瘤内高表达,且与预后相关;8、ECT2通过影响转录因子E2F1的蛋白水平影响PTTG1的表达;9、去泛素化酶PSMD14可以影响E2F1泛素化状态;10、ECT2通过PSMD14影响E2F1的泛素化降解从而影响PTTG1的表达。结论:1、PTTG1在胶质瘤内高表达,并能促进胶质瘤细胞的增殖。2、miR-520d-5p通过靶向PTTG1抑制胶质瘤细胞的增殖,并使细胞周期组织在G1期;3、ECT2通过促进去泛素化酶PSMD14的表达,抑制E2F1的泛素化降解,从而增加PTTG1的表达,进而促进胶质瘤细胞的增殖。