缺血性脑血管病是一种常见病，由于其发病机制尚不完全明了，目前尚无特效治疗，近年来的研究表明脑缺血缺氧损伤机制主要包括兴奋性氨基酸兴奋毒性作用、钙超载、自由基、NO和细胞凋亡等。谷氨酸兴奋毒性损伤是缺血性脑血管病的发病机制之一，因此谷氨酸损伤作用及机制目前受到广泛关注。大量研究结果证明一定损伤程度的谷氨酸可对体外培养的神经元产生毒性损伤作用。直至近几年人们开始关注谷氨酸损伤是否能够引起细胞凋亡的问题，人们认为一定浓度谷氨酸损伤有可能使神经元出现细胞凋亡。但是谷氨酸兴奋毒性损伤的机制并不是脑缺血损伤的唯一机制，脑缺血损伤时还会通过其他机制或途径造成损伤。 BDNF和GDNF是两种不同类别的神经营养因子(NTF)。NTF是可以调节 中文摘要 天津医科大学博士论文 周围和中枢神经系统发育及维持整个个体神经元结构与功能正常所必需一组 内源性可溶性蛋白质。研究发现这类因子不仅可以促进正常神经元的分化和 生长，对一些应激状态也有明显的保护性作用，特别是对于缺血性脑血管病 它们可以发挥重要的保护性作用。但是关于这类物质具体的作用机制目前尚 不完全明了，尤其是与细胞凋亡关系的问题在某些方面还有一些分歧。 因此我们设计如下实验：（1） 以腺病毒为载体转导80 NFNF、GD NF：门） 利用体外培养的海马神经元观察谷氨酸损伤模型和缺氧损伤模型的作用及其 与凋亡的关系（）观察重组腺病毒对体外培养海马神经元感染情况及重组 腺病毒转导的BDNF、GDNF蛋白表达情况。（4）观察重组腺病毒转导的 BDNF、GDNF对正常生长海马神经元细胞凋亡的影响及对谷氨酸损伤和缺 氧损伤细胞凋亡和b。12蛋白表达的影响。实验中主要包括免疫组化、原位凋 亡检测、Western Blotting检测等实验方法。通过观察腺病毒转导的BDNF和 GDNF在两种损伤模型中所起的作用，我们得出以下结果：外源性加入谷氨 酸和去除培养液中的氧气能使体外培养的海马神经元出现明显损伤，细胞存 活率明显下降同时细胞形态学也出现明显变化，如部分细胞水肿、死亡等； 重组腺病毒对体外培养的海马神经元的感染率能达到30％左右，而且Western SOttlllg买验结果表明目的蛋白也能被有效表达；腺病毒转导的BDw、 GDNF能使体外培养海马神经元谷氨酸和缺氧损伤细胞凋亡明显减少，并能 使h－2蛋白表达升高，根据以上结果我们得出以下结论： 1．体外培养海马神经元仍保持神经元原有特征，既可模仿在体内的状 态又可排除体内复杂因素对实验的影响。以MAI，2染色对所培养的神经细 胞进行鉴定，结果表明神经元在所有细胞中达90％以上。 二．重组腺病毒能够有效地感染体外培养的海马神经元并且能够将外源 性基因在海马神经元内有效表达并且对体外培养的海马神经元无明显毒性作 用。 3．谷氨酸损伤模型和缺氧损伤可对体外培养的海马神经元产生明显损 2 中文滴要 天津医科大学博士论文 伤作用，体外培养的海马神经元对这两种损伤均较为敏感。 4．腺病毒载体转导的BDNF、GDNF对正常培养的海马神经元生长具 有促进作用。 5．谷氨酸损伤和缺氧损伤均可使体外培养海马神经元B。l－二蛋白表达 下降，腺病毒载体转导的BDNF、GDNF可使损伤神经元BCI－2蛋白表达增 高，表明其作用机制可能与诱导B。12蛋白表达有关。 6．腺病毒载体转导的BDNF、GDM对体外培养海马神经元谷氨酸损 伤和缺氧损伤所致凋亡有明显抑制作用，其机制与以上两者能够促进Bcl．2 表达升高等机制有关。