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肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常见恶性肿瘤之一，通常发现较晚且病情发展迅速。化疗是肿瘤治疗中一种重要的方法，通常作为手术后的辅助治疗、肿瘤术后复发治疗和不能手术切除治疗的重要手段之一。化疗药物杀伤肿瘤细胞主要是通过促进其发生凋亡，而起到治疗肿瘤的目的。然而，在化疗过程中肿瘤细胞对化疗药物诱导的凋亡具有抵抗能力，某些肿瘤甚至可在化疗后出现耐药现象，严重影响了化疗效果。显然化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的同时激活了肿瘤细胞内的一系列生物信号，在内、外生物信号和药物诱导凋亡之间存在着平衡，促进和抑制凋亡因素之间的相互作用决定了细胞的生死。核因子κB(nuclear factorκB，NF-κB)是一类存在广泛、作用多样的转录因子，与凋亡、损伤、免疫反应等都有密切联系。近年来的研究发现核因子κB能被多种化疗药物特别是干扰核酸生物合成类抗肿瘤药所激活，例如5-氟尿嘧啶(5-Fu)、阿糖胞苷等，并且通过多种机制参与肿瘤细胞的肿瘤耐药的形成，表现出与肿瘤的化疗有密切的相关性。除此之外，还发现核因子κB与胚胎发育中的细胞凋亡也有相关性。人们逐渐认识到肿瘤的形成，以及肿瘤细胞先天形成的或后天获得的对化疗药物的耐药性与核因子κB所调节的细胞凋亡有关，即肿瘤细胞中核因子κB可能具有结构性激活或相关抑制因子表达缺失导致核因子κB过度激活。核因子κB的作用及其在实践中的应用已经成为当前研究的热点之一，是一个有待拓展并具有重要意义的研究方向。激活后的NF-κB在肿瘤细胞中主要发挥抑制凋亡作用，并且抗凋亡作用非常广泛，具有多样性，在多种肿瘤如肝癌、淋巴瘤、胃癌中都己经被证实。本课题旨在探讨核因子κB在肝癌细胞凋亡中的作用和意义，以及核因子κB特异性抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸盐(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)在肝癌化疗中的潜在应用价值，为阐明肝癌的发病机理和提高肝癌的化疗效果进行有益的探索。目的探索NF-κB在肝癌组织中的表达变化，以及与病理分期和抑癌基因TSLC1表达的相关性。人肝癌细胞(SMMC-7721)中NF-κB在化疗药物5-Fu诱导前和诱导后在细胞浆和细胞核中的表达变化，以及使用NF-κB的特异性抑制剂PDTC对NF-κB的激活进行抑制，观察这一过程中肝癌细胞SMMC-7721的凋亡变化。探讨肝癌细胞对化疗药物诱导凋亡发生抵抗的机理，从而为有效的提高肝癌化疗药物的治疗效果提供一定的实验基础。方法1．采用免疫组织化学EnVision法，检测NF-κB及抑癌基因TSLC1在60例肝细胞肝癌及15例正常肝组织中的表达，分析了其与临床病理特征的关系。2．四唑盐比色(MTT)实验检测在5-Fu作用下以及5-Fu、PDTC共同作用下SMMC-7721细胞生长抑制率的变化。3．免疫荧光(IF)法检测NF-κB被5-Fu激活时在细胞浆和细胞核的表达变化以及在5-Fu、PDTC共同作用下细胞质及细胞核中NF-κB的变化。4．提取SMMC-7721肝癌细胞核蛋白，运用Western blot法检测5-Fu、PDTC作用下和5-Fu、PDTC共同作用下核中NF-κB量的变化。5．流式细胞仪(FCM)法检测在5-Fu、PDTC作用下及5-Fu、PDTC共同作用下SMMC-7721细胞凋亡率变化。结果1．免疫组织化学EnVision法显示，NF-κB在肝癌组织和正常肝脏组织中的阳性表达率分别为53.3％，13.3％，两者间表达差异有统计学意义(P＜0.01)；TSLC1在肝癌组和正常肝组织组的阳性表达率分别为36.7％，80.0％，两者间表达差异有统计学意义(P＜0.01)。在病理分级间NF-κB的阳性表达差异有统计学意义(P＜0.05)且与TSLC1的阳性表达呈负相关(r=0.397 P＜0.05)。2．四唑盐比色试验：单用5-Fu 100μg／ml作用24h时，细胞生长抑制率仅为12.21％，而PDTC 50μM预处理1h后加入5-Fu使终浓度达到100μg／ml作用24h细胞生长抑制率则为31.43％。联合应用PDTC和5-Fu与单用5-Fu对SMMC-7721抑制率相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。3．免疫荧光法检测结果显示，在5-Fu诱导下NF-κB由细胞浆转移至细胞核，作用6h后NF-κB明显出现在细胞核中，12h左右达到高峰，而在细胞浆的表达逐渐减少。而在PDTC 50μM预作用后，NF-κB由细胞浆至细胞核的转移被明显抑制。4．Western blot法检测结果显示在3h、6h、12h三个时间点，SMMC-7721肝癌细胞NF-κB表达量在5-Fu组分别为0.28、0.59和0.72：在5-Fu+PDTC组分别为0.15、0.26和0.32；在PDTC组分别为0.09、0.12和0.14。5．流式细胞仪法检测PDTC组、5-Fu组、5-Fu+PDTC组肝癌细胞凋亡率分别为7.32％，9.42％和25.63％。结论1．NF-κB可能通过抗凋亡途径从而参与肝癌的发生、发展，它与抗凋亡基因TSLC1表达呈负相关提示NF-κB可能通过调控下游抗凋亡基因参与肝癌细胞的抗凋亡过程。2．肝癌细胞中NF-κBr可被5-Fu激活，进入细胞核内发挥抗凋亡作用，降低化疗效果。3．PDTC可以增强5-Fu对肝癌细胞凋亡的诱导作用，进一步提示NF-κB可以抑制肝癌细胞的凋亡。联合使用化疗药物和NF-κB特异性抑制剂能够有效提高肝癌患者的化疗效果。