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伪狂犬病(Pseudorabies)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的猪和多种家畜共患的一种急性,热性传染病。PRV主要感染猪,能够导致仔猪的高死亡率和种猪繁殖障碍,对养猪业危害极大。疫苗免疫是防控猪伪狂犬病的主要手段。然而自2011年底,PRV变异毒株在我国猪场出现并且流行,给养猪业造成了巨大的损失。最新的研究显示,现有商品化疫苗的保护效力显著下降,不能有效阻断这种变异株的传播和流行。本研究旨在以当前流行的PRV变异株(CH/HNSMX/2012株)为亲本,通过基因工程技术构建gI、gE、TK三基因缺失毒株rSMXΔgI/gEΔTK,通过一系列动物试验,研究了该毒株的安全性和免疫效力;为PRV变异株弱毒疫苗的研发与应用奠定了基础。1.伪狂犬病病毒流行毒株的分离鉴定和致病力研究本研究从85份病料样品中总共分离到16株PRV。空斑试验显示这16株PRV的空斑面积相似(0.4-0.8mm2),均显著高于经典毒株Ea株(0.2-0.5mm2)。对这16株PRV进行gC基因测序和进化分析,结果显示这16株PRV同源性非常高,和国内近期公布的PRV分离株的gC基因高度同源;因此可以初步判定,这16株PRV均属于PRV变异株。选择PRV CH/HNSMX/2012株作为变异株的代表,通过小鼠和仔猪感染试验研究其致病力。小鼠LD50试验结果显示CH/HNSMX/2012株和Ea株的LD50分别为19.5和154.2 TCID50。CH/HNSMX/2012株对小鼠的致病力显著强于Ea株。使用CH/HNSMX/2012株通过滴鼻途径感染60日龄仔猪,剂量分别为106.0、107.0、108.0TCID50;结果显示所有感染组均出现发热,食欲废绝,典型的神经症状和严重的呼吸道症状。106.0 TCID50感染组的5头猪中有3头仔猪死亡;而107.0和108.0 TCID50能够导致5头仔猪全部死亡。2.基因缺失病毒rSMXΔgI/gEΔTK的构建根据PRV基因组序列,选择gI/gE和TK基因两侧的序列作为同源臂,构建了重组转移载体;将重组转移载体和CH/HNSMX/2012基因组共转染PK-15细胞,获得重组病毒;通过空斑纯化,获得纯净的不带标记的基因缺失毒株rSMXΔgI/gEΔTK。RFLP和Southern Blot试验证明该毒株按照设计在gI/gE和TK两个区域发生了缺失,而基因组其他位置没有发生突变。rSMXΔgI/gEΔTK株的生长曲线和亲本株相似,但是空斑面积显著减小。细胞连续传代试验证明rSMXΔgI/gEΔTK遗传稳定。3.基因缺失株rSMXΔgI/gEΔTK的安全性评价使用101.0-107.0 TCID50剂量梯度的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒,通过足垫注射接种Balb/c小鼠,观察14d,接种小鼠未见临床感染症状。使用102.0-107.0 TCID50剂量梯度的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒,通过皮下注射接种新西兰大耳兔,观察21d,没有兔出现临床感染症状。使用108.0 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒,通过肌肉注射接种绵羊,观察21d,结果没有绵羊出现临床症状;同栏饲养的绵羊没有出现gB抗体转阳的现象。使用108.0 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒,通过肌肉注射和滴鼻两种途径,接种0日龄仔猪,观察28d,结果没有仔猪出现临床症状,仔猪生长速度正常;每个感染组设置的哨兵猪gB抗体维持阴性。使用108.0 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒,通过肌肉注射接种妊娠84日龄母猪;没有母猪出现发热,流产等临床症状,出生仔猪数和仔猪的健康度和生长速度完全正常,和对照组没有差异。综上所述,PRV rSMXΔgI/gEΔTK株不能导致小鼠、兔、绵羊、新生仔猪、妊娠母猪等易感动物出现症状,仅具有有限的水平传播能力,安全性较好,适合作为弱毒疫苗的候选毒株。4.基因缺失株rSMXΔgI/gEΔTK株对仔猪的免疫保护力评价分别使用106.0 TCID50剂量的rSMXΔgI/gEΔTK株弱毒疫苗,1头份Bartha-K61株弱毒疫苗(Merial,France),或者1mL DMEM免疫28日龄PRV阴性仔猪1次,免疫后28天采血检测抗体。中和试验结果显示rSMXΔgI/gEΔTK产生的血清中和抗体水平高于Bartha-K61疫苗。Bartha-K61疫苗产生的血清中和抗体中和Bartha-K61的中和效价显著高于中和CH/HNSMX/2012株的中和效价;而r SMXΔgI/gEΔTK株疫苗没有这个现象。免疫后28天使用CH/HNSMX/2012株滴鼻攻毒,剂量107.0TCID50;攻毒后对照组症状最严重,出现典型的神经症状和呼吸道症状,全部死亡。Bartha-K61组出现了严重的呼吸道症状,有3头猪出现神经症状,失去饲养价值。rSMXΔgI/gEΔTK组仅表现出一过性发热,轻微的精神沉郁和咳嗽,没有神经症状,攻毒后6天完全恢复。综上所述,r SMXΔgI/gEΔTK能够诱导机体产生较好的中和抗体,能够有效保护变异株致死剂量的攻毒;而Bartha-K61株则不能提供有效保护。