论文部分内容阅读
米根霉脂肪酶具有良好的1,3-位置特异性和立体选择性,在油脂加工、特种酯类生产、手性物质拆分及生物柴油等领域具有很高的应用价值。天然菌株产脂肪酶产量极低,通过基因工程和分子改造等手段实现脂肪酶的高效异源表达具有很重要的意义。本研究以米根霉为出发菌株,克隆得到米根霉脂肪酶的前导肽及成熟肽基因序列ProROL,并通过理性设计定向分子改造及共表达伴侣蛋白等手段大大提高了脂肪酶的表达量,实现了该基因在毕赤酵母菌株中的高效表达,初步分离纯化后测定了酶学性质,为其工业化应用打下基础。主要内容如下:(1)以米根霉基因组为模板,根据NCBI上已经公布的米根霉脂肪酶基因序列设计引物,成功得到了编码米根霉脂肪酶前导肽序列和成熟序列的基因ProROL,经过测序得知该基因与网上公布序列有三个位点不同,但二者编码同一氨基酸序列。成功构建了pPIC9K-ProROL质粒,线性化后电转化感受态毕赤酵母菌株(Pichia pastoris)GS115,通过筛选得到了阳性重组菌。摇瓶及7 L罐发酵结果显示,以p-NPP为底物,摇瓶诱导3.5 d后上清液酶活为10.6 U/mL,7 L罐诱导91 h后上清液酶活约126.8 U/mL,约是摇瓶发酵的11倍。(2)前导肽对脂肪酶的分泌与折叠起分子内伴侣蛋白的作用,通过生物信息学分析,采用SOE PCR的方法,成功将ProROL前导肽序列替换为ProRCL的前导肽序列,替换后的基因命名为ProAROL,并成功构建了表达载体。采用PCR依赖型方法,分别电转化含有伴侣蛋白和不含伴侣蛋白的宿主菌,并用荧光定量PCR的方法检测目的基因的拷贝数,成功获得了一系列不同拷贝数的重组菌。摇瓶发酵诱导发现,上清液酶活有了很大提高,其中H248菌株最高酶活为123.4 U/mL,BH128菌株最高酶活为152.3 U/mL,分别约是前导肽替换前的12倍和15倍。7 L罐诱导发酵中,H248菌株最高酶活为4059.6 U/mL,是摇瓶发酵的33.8倍,该酶活是目前报道的关于米根霉脂肪酶的最高表达水平。用共表达伴侣蛋白和不共表达伴侣蛋白拷贝数均为2的重组菌株进行了摇瓶发酵对比,发现共表达伴侣蛋白不仅酶活提高,并且可以缩短发酵时间。(3)通过阳离子交换柱层析和疏水柱层析,ProAROL得到了较好的纯化,纯化倍数为5.61倍;ProROL经过阳离子交换柱后纯化了3.90倍。(4)测定了ProAROL和ProROL的酶学性质。两种酶的最适温度都为40℃,温度稳定性ProAROL好于ProROL,ProROL在40℃时能保持70%以上的酶活力,而ProAROL在40℃能保持85%以上的酶活力,高于45℃时两者酶活均迅速下降;两种酶的最适pH值为8.5左右,在pH 8.0-9.0范围内能保持80%以上的酶活力。在pH 6.0-10.0范围内,保温1 h后,均能保持50%以上的酶活力,显示了较好的pH稳定性;测定了ProAROL和ProROL的动力学参数,Km值分别为0.440 mM和0.442 mM,kcat分别为1.30×104和9.75×103;ProROL和ProAROL二者均对链长为C12-C16的中长链脂肪酸有较高的选择性,对C8-C18脂肪酸的选择性均大于40%,而对短链脂肪酸的选择性较低。采用水解法检测了酶的1,3-位置特异性,结果表明ProROL和ProAROL都具有良好的1,3-位置特异性;采用1-辛酸与1-辛醇酯化生成辛酸辛酯,反应24 h后,两种酶的转化率均在95%以上。