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目的神经管畸形(neural tube defects,NTD)是人类常见先天畸形,是影响人口素质的最常见、最严重的出生缺陷性疾病之一。它是由于在胚胎发育过程中,神经管闭合不全所引起的一组缺陷,包括无脑畸形、脑膨出和脊柱裂等。它们在病因学上是多因素的,是遗传学因素和环境因素共同作用结果。胚胎脑发育的早期阶段主要是神经板隆起、弯曲、闭合形成神经管,神经管的头部从前向后依次发育形成脑的基本组织形态,即端脑、间脑、中脑、后脑,在神经管闭合过程中出现异常就会导致NTD。发育生物学研究表明,细胞凋亡现象在发育过程中普遍存在,对于多细胞生物的组织和形体构建具有重要作用。细胞凋亡和细胞增殖与分化相同,都是胚胎发育过程中的一部分,是由一系列相关基因所控制。胚胎发生过程中凋亡即细胞死亡,这对于整体构型布局与组织形成是极为重要的。过多或过少的凋亡都能干扰整个机体和器官的正常发育及形态形成。Caspase-3是一种活化的参与细胞程序性死亡的蛋白酶。Caspase-3基因敲出鼠表现出明显的神经管畸形表型,这部分原因归咎于神经元细胞细胞凋亡功能的丧失。许多资料显示NTD与细胞凋亡有关,目前,有多种通路可以解释凋亡的发生机制,其中caspase蛋白酶家族在死亡受体介导的细胞凋亡通路中起关键作用。该通路通过激活caspase-4,caspase-7,caspase-8,caspase-3,caspase-6多个成员的级联反应,最终引起细胞凋亡。研究发现,caspase-3基因敲出的小鼠易早死,因其脑中皮层、小脑、纹状体、海马各区细胞出现了异常增殖,表明caspase-3在神经细胞凋亡中起着重要的作用。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是真核生物信号传递网络中的重要途径之一。目前已发现存在着多条并行的MAPK信号转导通路,不同的细胞外刺激可以激活不同的MAPK信号通路,许多生长因子、细胞因子、G蛋白偶联受体、应激信号及有丝分裂原等均可激活MAPK信号转导通路。MAPK信号转导通路在细胞的增殖、分化和凋亡中起着关键作用。在哺乳动物5种不同的MAPK信号转导通路中,c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase,JNK)和P38MAPK信号转导通路在炎症与细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用。因此,本研究以胚胎12、15、17和20天神经管畸形大鼠为研究对象,采用HE染色法、免疫组织荧光染色法、Western-blot法观察胚胎12天、15天、17天和20天神经管畸形大鼠神经组织细胞caspase-3表达和分布,并进一步对caspase-3表达和MAPK家族JNK蛋白磷酸化的关系进行了初步探讨。对于深入探讨神经管畸形的病理演变规律具有重要意义。方法一、神经管畸形大鼠模型制作与动物分组1、维甲酸溶于橄榄油中(40mg/ml),以剂量为135mg/kg给药,经胃管注入孕10天Wister大鼠制作神经管畸形大鼠模型,给等量橄榄油为对照组。2、实验分组:对照组和脊柱裂组按照孕12天、15天、17天和20天分为4个亚组。二、脊柱裂畸形组胎鼠脊髓组织细胞凋亡情况分析以及细胞凋亡信号通路中caspase-3与MAPK家族JNK的关系1、应用免疫组织化学方法检测caspase-3在对照组、畸形组胎鼠脊髓组织细胞中的分布和表达。2、应用Western blot方法检测畸形组与对照组胎鼠脊髓组织MAPK家族中JNK磷酸化情况。结果一、神经管畸形大鼠模型在大鼠孕10天给予维甲酸(135mg/kg体重),孕12天、15天、17天、20天剖腹取出胎鼠可发现脑膨出、脊柱裂、无尾、肛门闭锁等多种畸形。二、大鼠胚胎12天、15天、17天、20天对照组和脊柱裂畸形组脊髓神经组织caspase-3表达情况分析用免疫荧光染色方法可发现胚胎15天、17天和20天显性脊柱裂畸形鼠脊髓组织caspase-3阳性细胞数多于对照组,荧光强度高于对照组。胚胎15天、17天、20天显性脊柱裂畸形鼠脊髓组织caspase-3阳性细胞数明显多于胚胎12天显性脊柱裂畸形组。三、大鼠胚胎12天、15天、17天、20天对照组和脊柱裂畸形组脊髓神经组织中MAPK家族JNK磷酸化情况用Western-blot方法检测不同组胎鼠脊髓神经组织中MAPK家族JNK磷酸化水平,结果表明胚胎12天、15天、17天和20天脊柱裂畸形鼠脊髓神经组织JNK磷酸化水平高于对照组。脊柱裂畸形鼠胚胎15天脊髓神经组织JNK磷酸化水平达到峰值。结论1、胚胎12、15、17、20天显性脊柱裂胎鼠脊髓组织caspase-3阳性细胞数目从胚胎15天开始明显增多,提示细胞进入凋亡高峰阶段。2、显性脊柱裂胎鼠脊髓神经组织细胞MAPK家族JNK磷酸化在胚胎15天达到峰值,同时显性脊柱裂胎鼠脊髓组织caspase-3阳性细胞数目从胚胎15天开始明显增多,提示凋亡蛋白caspase-3表达增多与MAPK家族JNK信号通路相关,说明异常细胞凋亡参与了维甲酸诱导显性脊柱裂胎鼠形成过程,并且此异常的细胞凋亡可能与MAPK家族JNK细胞凋亡信号转导通路相关。